Microphysiological System-Generated Physiological Shear Forces Reduce TNF-α-Mediated Cartilage Damage in a 3D Model of Arthritis

Keywords: TNF‐α; articular cartilage breakdown; chondrogenic 3D model; immune cells; matrix degeneration; mesenchymal stromal cell; microfluidic system; pro‐inflammatory cytokine.

進行性軟骨退化和軟骨下骨破壞是兩種主要關節疾病的標志：骨關節炎（OA）和類風濕性關節炎（RA）。關節軟骨是一種富含細胞外基質（ECM）的組織，由 60%–80% 的水、20% 的蛋白聚糖/聚集蛋白聚糖、5% 的 II 型膠原蛋白（Col）和 1%–5% 的軟骨細胞組成。

壓縮應力和剪切應力是主要的機械應力，如果它們過大會導致軟骨和關節功能障礙、損傷和疼痛。生理水平的壓縮和流體剪切應力通過促進軟骨細胞增殖、ECM 產生、生長和分化對關節軟骨產生積極影響。然而，這種機械應力也會產生負面影響，例如當過度壓縮應變時會導致軟骨細胞死亡和促炎因子的分泌。此外，由于必要的機械應力供應不足，低生理應力會導致軟骨細胞凋亡和基質降解。

傳統的體內模型難以分離和研究機械應力對軟骨健康的具體影響。目前，在臨床前研究中，在體外 3D 人類軟骨微結構（CMCs）上模擬關節運動過程中機械應力的微生理系統（MPSs）變得越來越重要。這些 3D CMCs 整合了細胞、可溶性因子和 ECM 樣基質，提供了細胞間相互作用和對基質產生和降解的見解，以模擬關節軟骨。

因此，德國柏林夏里特醫院風濕病學和臨床免疫學系、瑞士西北應用科學與藝術大學生命科學學院的團隊聯合開發了一種可施加剪切應力的 MPS，從而產生類似于在體內關節運動期間觀察到的生物反應。該研究證明了生理剪切應力保護 CMC 免受 TNF-α介導的關節炎的影響；另一方面，病理學上的低機械應力使基質沉積和再吸收的平衡在 TNF 處理后轉向分解代謝，這種效果可以通過 JAK 抑制來恢復。研究成果發表于 Advanced Science 期刊題為“Microphysiological System-Generated Physiological Shear Forces Reduce TNF-α-Mediated Cartilage Damage in a 3D Model of Arthritis”。

首先，使用低生理（0 Pa）與生理（0.2 Pa）力在 MPS 中將 CMC 暴露于流體剪切應力，檢測分析細胞活力和細胞凋亡，發現其對細胞活力和死亡沒有影響，但細胞凋亡顯著減少（圖1 a-d）。然后，分析了 ECM 標志物 ACAN、COL2A1、COL1A1、COMP 和基質降解酶MMP1、MMP3 和 MMP13 的基因表達，觀察到 ACAN、COL2A1 的表達較高，COL2A1 與 COL1A1 的比率較高，但在 0.2 Pa 的流體剪切力下（對應于生理力條件）下，COL1A1、COMP 和 MMP13 的表達較低，這表明軟骨形成增強，ECM 形成以及 ECM 降解減少（圖1 e）。

在蛋白質水平上，CMCs 表現出更高的軟骨特異性 ECM 沉積物，例如 II 型膠原蛋白（COL2）和聚集蛋白聚糖（ACAN），而 I 型膠原蛋白（COL1）和基質降解酶（MMP1 和 MMP13）在 0.2 Pa 的流體剪切應力下表達較少（圖1 f）。值得注意的是，促纖維化收縮肌動蛋白亞型α 平滑肌肌動蛋白（αSMA）在 0.2 Pa 時表達較低。有趣的是，實驗觀察到 CMCs 的內、中、外段對機械應力的不同響應。具體來說，在生理剪切應力下，合成代謝軟骨形成 ECM 成分，如 COL2 和 ACAN，在比較的外部部分主要表達較高。相反，與外部相比，COL1 在內部部分的表達更高。在生理剪切應力下，分解代謝 MMP1 和 MMP13 表達量保持不變，而在 0 Pa 的流體剪切應力下表達較高。值得注意的是，促纖維化 αSMA 僅在 0 Pa 時表達較高。

這些結果表明，在長期生理剪切應力條件下培養 CMCs 會觸發合成代謝基因的表達，促進軟骨發育，并對 CMC 的內、中、外區域的軟骨細胞凋亡和基質降解產生差異影響。

圖1     14 天的生理流體剪切應力可保護 CMC 免受細胞凋亡和基質降解，從而形成成熟的 3D CMC。

為此，用 TNF-α（100 ng ml）刺激 CMC 6 小時，發現 TNF-α 刺激顯著降低了 Calcein-AM+ 細胞的相對數量（作為細胞存活的衡量指標），但在 0.2 Pa 模擬關節運動時降低程度較低。此外，與未處理的 0.2 Pa 組相比，0.2 Pa 的 TNF-α 處理導致 BCL2-BAX 比率降低，但仍高于 0 Pa 組。WST-1 水平在 TNF-α 處理后在 0 Pa 時比在 0.2 Pa 時增加的程度更高，表現出更高的代謝活性，而 0.2 Pa 的 TNF-α 處理減少了氧攝取和乳酸產生，表明葡萄糖攝取降低。然后，分析了 TNF-α介導的 IL-6 分泌作為 CMC 炎癥反應的指標，發現隨著時間的推移，在 0 Pa 條件下 TNF-α 的降低伴隨著 IL-6 分泌的增加，而在 0.2 Pa 條件下觀察到可溶性促炎細胞因子 IL-6 的水平顯著降低。這些數據表明，生理性剪切力減少TNF-α刺激的CMC細胞凋亡和IL-6分泌。

TNF-α 可以通過誘導 MMPs 的表達導致聚集蛋白聚糖和 II 型膠原蛋白的降解。因此，接下來研究了 0 和 0.2 Pa 剪切應力對 TNF-α介導的炎性 IL6、TNFA 和 IL8、促纖維化 TGFB 和參與 ECM 周轉的分子 ACAN、COL2A1、COL1A1、COMP、MMP1、MMP3 和 MMP13 基因表達的影響（圖2 a）。雖然 IL6、TNFA 和 IL8 不受不同剪切應力的影響，但與低生理力相比，0.2 Pa 的生理剪切應力降低了促纖維化 TGFB 和 COMP。值得注意的是，0.2 Pa 的生理條件下 ACAN、COL2A1 的表達顯著升高，COL1A1 表達降低，從而增加 COL2A1 與 COL1A1 的比率。TNF-α刺激后 MMP1 和 MMP13 在 0 Pa 時的表達顯著升高（圖2 a）。

利用免疫熒光分析確定負責維持 0.2 Pa 下 CMC 生理機能的區域，發現CMCs 的內部區域對剪切應力引起的 ECM、COL2 和 ACAN 的合成代謝分子的變化敏感。外部區域對 ECM 的分解代謝分子，即 MMP1 和 MMP13 敏感（圖2 b、c）。值得注意的是，ACAN 似乎也受到了外部區域的影響。

這些結果表明，0.2 Pa 的生理剪切應力可能在維持 MPS 中的 CMC 穩態方面具有保護作用，而 0 Pa 的低生理剪切應力則支持 CMC 損傷。

圖2    生理剪切應力可防止 TNF 介導的 CMC 損傷，維持 CMC 穩態，而低生理剪切應力支持 TNF 介導的 CMC 損傷。

最后，添加 JAK 抑制劑（JAKi）巴瑞替尼（baricitinib）處理 PBMCs 和 CMCs（圖3 a）。確認了添加活化的 PBMCs 或它們與巴瑞替尼的組合不會影響 CMCs 的活力、細胞毒性或細胞凋亡（圖3 b、c）。其次，發現 PBMC-介導的 caspase 3/7 活性的顯著誘導（圖3 c）和 BCL2 與 BAX 比率的降低（圖3 d），這被巴瑞替尼處理逆轉。添加活化的 PBMCs 導致軟骨細胞和免疫細胞的代謝率改變。雖然培養基的氧飽和度最初降低，但與未處理的 CMCs 相比，兩天后氧飽和度增加。添加巴瑞替尼恢復了培養基的氧飽和度（圖3 e）。值得注意的是，培養基氧飽和度的降低表明細胞耗氧量增加。用活化的 PBMCs 處理的 CMCs 中培養基中葡萄糖的含量比單獨的 CMCs 減少得少，但比用活化的 PBMCs 和添加巴瑞替尼處理的 CMCs 減少得更多（圖3 f）。當用活化的 PBMCs 處理 CMCs 時，乳酸量隨著時間的推移而增加。相反，添加巴瑞替尼導致乳酸水平與在未處理的 CMCs 中觀察到的乳酸水平相似（圖3 f）。

在基因表達水平上，免疫細胞介導的 CMCs 激活顯著增加了 IL6 和 IL1B 以及基質降解酶的表達，這導致 RA 的關鍵現象——軟骨降解（圖3 g）。這些影響也可以通過 JAK 抑制來減弱。在形態學上，含有細長細胞的外部區域在使用活化的 PBMCs 刺激后消失，從而顯示出淺表細胞層浸漬的跡象（圖3 h）。此外，免疫細胞誘導導致軟骨 ECM 分解的 MMP1 和 MMP13 表達增加，并被巴瑞替尼消除（圖3 h）。

關節炎 CMC 的藥理學驗證了，活化的 PBMCs 降低 ACAN 和 COL2A1 表達并促進 MMP1 和 MMP13表達，而 JAK 抑制劑巴瑞替尼則相反。

圖3    激活的 PBMCs 誘導體液介導的 CMC 損傷、炎癥介質和 MMP，這些損傷被隨后的 JAK 抑制減弱。

該研究揭示了關節炎樣表型的發展，并在生理剪切應力下，通過 JAK 抑制劑成功恢復了軟骨狀況。生理剪切應力被認為是維持軟骨完整性的關鍵因素。該 MPS 提供了一種標準化方法來研究剪切應力、復制細胞因子誘導的軟骨損傷和模擬關節炎的關鍵特征，為動物模型提供了有價值的替代方案。

參考文獻：Damerau A, Nguyen DHD, Lubahn C, Renggli K, Pfeiffenberger M, Kr?nke G, Herrmann M, Leeuw T, Buttgereit F, Gaber T. Microphysiological System-Generated Physiological Shear Forces Reduce TNF-α-Mediated Cartilage Damage in a 3D Model of Arthritis. Adv Sci (Weinh). 2024 Dec 24:e2412010. doi: 10.1002/advs.202412010. Epub ahead of print. PMID: 39716911.

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