Dental Pulp Stem Cells Modulate Inflammasome Pathway and Collagen Deposition of Dermal Fibroblasts

Keywords: dental pulp stem cells; fibroblasts; fibrosis; inflammasome; inflammation.

纖維化是一種病理狀態(tài)，幾乎可以影響身體的所有組織，以成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過量沉積和重塑為特征。纖維化主要由促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)的慢性刺激觸發(fā)。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）可以協(xié)同作用，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)。這些細(xì)胞因子，除了轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β 外，還可由活化的巨噬細(xì)胞釋放，其已被證明可以激活成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致ECM 蛋白、內(nèi)皮細(xì)胞、新血管生成過程、角質(zhì)形成細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的過量產(chǎn)生。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）之間的失衡，以及隨之而來的膠原沉積過剩，是纖維化發(fā)生、肌成纖維細(xì)胞持續(xù)活化和慢性炎癥反應(yīng)的最重要因素之一。此外，炎癥和組織修復(fù)的主要方面，如纖維化，也受炎癥小體的調(diào)節(jié)。炎癥小體是一組多聚體蛋白復(fù)合物，能夠識別不同炎癥誘導(dǎo)的刺激并控制半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶-1（CASP-1）的活化，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子（IL-1β）和 IL-18 的成熟，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。研究最多的炎癥小體是包含 NOD-、LRR- 和 pyrin 結(jié)構(gòu)域的蛋白3（NLRP3）和黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）。

人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）是一類存在于人牙髓組織中間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），具有高增殖率、體外和體內(nèi)的廣泛的分化潛力以及低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)特性，后者通過激活不同的機(jī)制作用于免疫細(xì)胞。然而，MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用，特別是DPSCs在纖維化中的免疫調(diào)節(jié)作用，仍未被理解。

基于此，意大利摩德納雷焦艾米里亞大學(xué)生命科學(xué)系及醫(yī)學(xué)、牙科和形態(tài)學(xué)科學(xué)系團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究分析了 hDPSCs 在促炎環(huán)境中調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞炎癥小體激活和纖維化活性的潛力，數(shù)據(jù)表明培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和 DPSCs 之間存在串?dāng)_，這似乎調(diào)節(jié)了參與炎癥小體激活、ECM 沉積、傷口愈合和纖維化的基因。研究成果發(fā)表于 CELLS 期刊題為“Dental Pulp Stem Cells Modulate Inflammasome Pathway and Collagen Deposition of Dermal Fibroblasts”。

首先，建立成纖維細(xì)胞和DPSCs 共培養(yǎng)系統(tǒng)來模擬體內(nèi)促炎環(huán)境，并用脂多糖（LPS）或促炎細(xì)胞因子 TNF-α 和 IL-1β 的組合刺激DPSCs。LPS處理的成纖維細(xì)胞中炎癥相關(guān)基因 IL1B 轉(zhuǎn)錄水平的強(qiáng)烈增加。當(dāng)與 DPSC 共培養(yǎng)時，與未處理的細(xì)胞相比，LPS 處理后 IL-1β 的水平增加了 102 倍，這表明 LPS 在細(xì)胞共培養(yǎng)時增強(qiáng)了 IL-1β 的表達(dá)。同時，在與 DPSC 共培養(yǎng)時的成纖維細(xì)胞中檢測到IL6 的顯著上調(diào)，表明暴露于LPS時 DPSCs 對 IL6的增加有直接貢獻(xiàn)。此外，在任何測試條件下LPS 似乎都沒有顯著改變 IL18 的表達(dá)。至少在某種程度上，這些影響可能歸因于TLR4 表達(dá)的調(diào)節(jié)，TLR4 表達(dá)通過 LPS 和 TNF-α + IL-1β 的刺激而增加。

當(dāng)用 TNF-α 和 IL-1β 刺激與 hDPSCs 共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞時，IL1B 和 IL6 的表達(dá)急劇增加，IL-18 mRNA 表達(dá)水平也增加，但IL-18 顯示出統(tǒng)計學(xué)上的下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，hDPSCs 可以對暴露于 TNF-α 和 IL-1β 的成纖維細(xì)胞中的促炎性 IL18 表達(dá)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

然后，探討用 LPS 或 TNF-α 和 IL-1β 處理是否也可以改變炎癥小體的表達(dá)并確定促炎細(xì)胞因子的更高釋放。因此，評估了 AIM2、PYD 和包含 CARD 結(jié)構(gòu)域（PYCARD）、NLR 凋亡抑制蛋白（NAIP）、NLRP3 和 CASP1 基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LPS 處理導(dǎo)致僅在成纖維細(xì)胞中 AIM2 和 CASP1 的表達(dá)大幅增加，與 DPSCs 共培養(yǎng)將這種效果提高了三倍（圖1 A）。相反，NLRP3 在成纖維細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，LPS 也不影響。

用 TNF-α 和 IL-1β 刺激導(dǎo)致成纖維細(xì)胞中 AIM2 的表達(dá)增加，與 DPSCs 共培養(yǎng)增強(qiáng)這種表達(dá)（圖1 B）。此外，在這種情況下，NLRP3 不受 TNF-α 和 IL-1β 的影響。在成纖維細(xì)胞中單獨(dú)用 LPS 或促炎細(xì)胞因子處理或與 DPSCs 共培養(yǎng)后，未觀察到對 PYCARD 或 NAIP 表達(dá)的顯著影響。在這些細(xì)胞中，無論是在基礎(chǔ)條件下還是在刺激后，IL-1β 和 IL-18 的表達(dá)都幾乎無法檢測到。然而，它們確實(shí)表達(dá)了 IL-6，其水平被 TNF-α 和 IL-1β 強(qiáng)烈上調(diào)。

這些數(shù)據(jù)表明，用 LPS 或 TNF-α 和 IL-1β 刺激誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中促炎條件的激活，并且與 DPSCs 共培養(yǎng)對炎癥環(huán)境有促進(jìn)作用。

圖1    （A）AIM2 和 CASP1 在用 LPS 處理 4 小時的成纖維細(xì)胞中相對表達(dá)，單獨(dú)或與 DPSC 共培養(yǎng)。（B）用 TNF-α 和 IL-1β 處理 4 小時的成纖維細(xì)胞中 AIM2 和 CASP1 的相對表達(dá)，單獨(dú)或與 DPSC 共培養(yǎng)。

為了確定基因的上調(diào)是否導(dǎo)致成纖維細(xì)胞釋放更高的細(xì)胞因子，接下來評估了它們在刺激細(xì)胞上清液中的水平，發(fā)現(xiàn)用 TNF-α + IL-1β 刺激 4 小時后，單獨(dú)的成纖維細(xì)胞顯示 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 表達(dá)水平增加。有趣的是，相對于單獨(dú)培養(yǎng)的刺激成纖維細(xì)胞，與DPSCs 共培養(yǎng)的刺激成纖維細(xì)胞中觀察到 TNF-α 顯著降低和IL-6 的上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，DPSCs 本身可以調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子。

繼續(xù)驗(yàn)證與 DPSCs 的共培養(yǎng)是否也能調(diào)節(jié)纖維化過程。因此，評估了一系列對膠原蛋白沉積和纖維化至關(guān)重要的基因的表達(dá)，即 TGF-β、FN1、COL1A1、COL3A1，發(fā)現(xiàn)無論 LPS 的刺激如何，僅與 DPSCs 共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中 TGF-β 水平增加，這表明 DPSCs 產(chǎn)生了一種可以調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞 TGFB 轉(zhuǎn)錄的因子（圖2）。當(dāng)用 TNF-α 和 IL-1β 刺激共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞時，檢測到 TGF-β 表達(dá)略有增加（圖2 B）。LPS 刺激后成纖維細(xì)胞中 FN1 的表達(dá)未檢測顯著差異，而暴露于 TNF-α 和 IL-1β 的共培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中 FN1 顯著上調(diào)（圖2 B）。就膠原基因而言，COL1A1在與DPSCs共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中表現(xiàn)出增加的趨勢，而在LPS處理的單獨(dú)成纖維細(xì)胞中則沒有增加的趨勢；在用 LPS 處理并與 DPSCs 共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中觀察到 COL3A1 的顯著增加。此外，與未刺激的成纖維細(xì)胞相比，TNF-α 和 IL-1β 刺激誘導(dǎo) COL3A1 上調(diào)，但與 DPSCs 共培養(yǎng)似乎降低了COL3A1 表達(dá)。

DPSC 共培養(yǎng)的效應(yīng)在用 LPS 或 TNF-α 和 IL-1β 刺激的成纖維細(xì)胞中觸發(fā)不同的反應(yīng)，特別是暴露于 LPS 誘導(dǎo)的增強(qiáng)的促纖維化環(huán)境，而當(dāng)進(jìn)行 TNF-α 和 IL-1β 刺激時，DPSCs 似乎調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞對 ECM 成分的表達(dá)。

圖2    （A）編碼 TGF-β 和 FN1 的基因在用 LPS 處理 4 小時的單獨(dú)或與 DPSC 共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中。（B）編碼 TGF-β 和 FN1 的基因在用 TNF-α 和 IL-1β 處理 4 小時的單獨(dú)或與 DPSC 共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中。

最后，為了進(jìn)一步研究 LPS 或 TNF-α + IL-1β 刺激如何影響成纖維細(xì)胞的纖維化反應(yīng)，無論是否與 DPSCs 共培養(yǎng)，測定了纖維化標(biāo)志物α-SMA和纖連蛋白的表達(dá)，以及與 ECM 重塑相關(guān)的MMP-9的表達(dá)。

用 LPS 處理后未觀察到顯著變化。當(dāng)用 TNF-α + IL-1β 處理時，成纖維細(xì)胞顯示出 α-SMA 表達(dá)的下降趨勢，與 DPSCs 共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中纖連蛋白水平顯著降低（圖3 A）。數(shù)據(jù)還表明，與 DPSCs 共培養(yǎng)后，MMP-9 在受刺激的成纖維細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖3 A）。免疫熒光分析的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了，當(dāng)與 DPSCs 共培養(yǎng)時，成纖維細(xì)胞顯示 α-SMA 和 COL1A1 的表達(dá)降低，FN1 的排列減少，同時 MMP-9 的表達(dá)增加（圖3 B）。這些發(fā)現(xiàn)表明，DPSCs 在 TNF-α + IL-1β 刺激下調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的促纖維化表型（圖3 B）。

基于上述數(shù)據(jù)，研究了 LPS 和 TNF-α/IL-1β 刺激是否影響 DPSCs 的生物學(xué)特性和表型，檢測了血小板衍生生長因子受體β（PDGFRβ）（一種典型的周細(xì)胞標(biāo)志物）和PD-L1（一種關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)分子）的表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示，LPS 和 TNF-α/IL-1β 刺激均未誘導(dǎo) PDGFRβ 表達(dá)的任何顯著差異，證實(shí) DPSCs 的周細(xì)胞樣性質(zhì)在任何實(shí)驗(yàn)組中均未發(fā)生改變。有趣的是，當(dāng)對單獨(dú)培養(yǎng)和與成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)的 DPSCs 進(jìn)行 TNF-α/IL-1β 刺激時，PD-L1 表達(dá)增加。

圖3    （A）用 TNF-α 和 IL-1β 處理 24 小時的單獨(dú)或與 DPSC 共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中纖連蛋白（FN1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和金屬蛋白酶 9 （MMP-9） 的代表性免疫印跡和相對蛋白表達(dá)。（B）用 TNF-α 和 IL-1β 處理 24 小時單獨(dú)或與 DPSC 共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的代表性共聚焦顯微鏡圖像。

總之，這項(xiàng)研究數(shù)據(jù)表明，成纖維細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞之間存在串?dāng)_，其中后者在暴露于炎癥刺激時既不改變其神經(jīng)嵴相關(guān)表型，也不改變其生物學(xué)特性，并且確實(shí)調(diào)節(jié)參與炎癥小體激活、ECM 沉積以及傷口愈合和纖維化的基因。值得注意的是，暴露于不同促炎刺激的牙髓干細(xì)胞可以增強(qiáng)參與炎癥小體激活的基因的轉(zhuǎn)錄，而它們可以調(diào)節(jié)促纖維化環(huán)境，減少 ECM 沉積，從而有助于組織穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)。這些結(jié)果可能為進(jìn)一步研究成纖維細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞之間的時間依賴性相互作用以及牙髓干細(xì)胞在調(diào)節(jié)纖維化提供參考。

參考文獻(xiàn)：Zanini G, Bertani G, Di Tinco R, Pisciotta A, Bertoni L, Selleri V, Generali L, Marconi A, Mattioli AV, Pinti M, Carnevale G, Nasi M. Dental Pulp Stem Cells Modulate Inflammasome Pathway and Collagen Deposition of Dermal Fibroblasts. Cells. 2024 May 14;13(10):836. doi: 10.3390/cells13100836. PMID: 38786058; PMCID: PMC11120068.

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