Flipper-TR是一種熒光探針，能夠特異性靶向細(xì)胞的質(zhì)膜，并通過(guò)其熒光壽命的變化報(bào)告膜張力的變化。它是Flipper探針家族中先進(jìn)的成員（參見(jiàn)文獻(xiàn)2和3），通過(guò)機(jī)械感受基團(tuán)中兩個(gè)扭曲的二噻吩并噻吩之間的扭轉(zhuǎn)角度和偏振的變化來(lái)感知脂質(zhì)雙層膜的組織變化。Flipper-TR能夠自發(fā)地插入細(xì)胞的質(zhì)膜中，并且只有在插入脂質(zhì)膜時(shí)才會(huì)發(fā)出熒光。它具有寬吸收和發(fā)射光譜，通常可以用488 nm激光進(jìn)行激發(fā)，而發(fā)射光則在575至625 nm之間收集。Flipper-TR適用于多種生物體，包括細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物和植物。

艾美捷Flipper TR膜張力傳感器（CY-SC020）光物理特性：

- 吸收波長(zhǎng)（λabs）：480 nm

- 發(fā)射波長(zhǎng)（λem）：600 nm

- 大摩爾吸光系數(shù)（εmax）：1.66×10? mol?1·cm?1（DMSO中）

- 熒光壽命：2.8 - 7 ns

- 量子產(chǎn)率（QY）：30%（乙酸乙酯中）

Flipper TR膜張力傳感器的作用機(jī)制示意圖：

圖：左側(cè)為Flipper-TR分子的示意圖。中間為低張力脂質(zhì)雙層，其中Flipper呈扭曲狀態(tài)；右側(cè)為探針呈平面狀態(tài)。

儲(chǔ)存與操作：

收到后將探針儲(chǔ)存于-20°C。使用新鮮且無(wú)水的DMSO配制探針溶液（因?yàn)殛惻f和含水的DMSO會(huì)顯著縮短探針的保質(zhì)期）。使用后將探針溶液儲(chǔ)存于-20°C。在打開(kāi)前，應(yīng)將小瓶恢復(fù)至室溫。如果儲(chǔ)存得當(dāng)，溶液中的探針應(yīng)可在3個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定。注意：DMSO溶液應(yīng)特別小心處理，因?yàn)?span style="font-family: Calibri;">DMSO已知會(huì)促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。請(qǐng)按照所有相關(guān)的當(dāng)?shù)匾?guī)定處理這些試劑。

標(biāo)記協(xié)議：

注意：本協(xié)議是使用貼壁于蓋玻片的HeLa細(xì)胞優(yōu)化的，并已在其他常見(jiàn)細(xì)胞系中得到驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)協(xié)議的建議應(yīng)作為起點(diǎn)，每種細(xì)胞類型的優(yōu)標(biāo)記條件應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。

1. 配制1 mM儲(chǔ)備液：將Flipper-TR小瓶的內(nèi)容物溶解在50 µL無(wú)水DMSO中，制備1 mM儲(chǔ)備液。該溶液應(yīng)儲(chǔ)存于-20°C或更低溫度。不要將溶液分裝成小份，因?yàn)樗鼈儠?huì)更快降解，且該化合物不會(huì)因多次凍融循環(huán)而改變。如果儲(chǔ)存得當(dāng)，該儲(chǔ)備液應(yīng)可在三個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定。（可選）如果需要準(zhǔn)確測(cè)定儲(chǔ)備液的濃度，可將1 µL 1 mM儲(chǔ)備液稀釋在99 µL DMSO中。在425 nm處測(cè)量吸光度。使用上述給定的消光系數(shù)計(jì)算濃度。

2. 配制染色液：在應(yīng)用于細(xì)胞之前，將Flipper-TR稀釋至所需濃度（從1 µM開(kāi)始）的細(xì)胞培養(yǎng)基中（不要在使用前保存染色液超過(guò)2小時(shí)）。注意：當(dāng)使用含有胎牛血清（FCS）或其他血清的細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，與不含血清的培養(yǎng)基相比，標(biāo)記效率可能會(huì)降低。如果觀察到信號(hào)較低，可以將探針濃度增加至2 µM。

3. 細(xì)胞準(zhǔn)備和染色：按照常規(guī)方法在蓋玻片、玻璃底培養(yǎng)皿或玻璃底多孔板上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需密度時(shí)，用染色液替換培養(yǎng)基，確保所有細(xì)胞都被溶液覆蓋。將細(xì)胞置于37°C、含5% CO?的濕潤(rùn)環(huán)境中孵育15分鐘，然后進(jìn)行成像。30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間后，由于膜的周轉(zhuǎn)，可能會(huì)觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記。然而，其他含有膜的細(xì)胞器（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體）的標(biāo)記是有限的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)通常具有較短的壽命。可選地，可以移除含有探針的培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。由于探針僅在膜中具有熒光，因此不需要移除探針，特別是在計(jì)劃進(jìn)行長(zhǎng)期成像（>24小時(shí)）且培養(yǎng)基中含有血清的情況下。在低于1 µM的探針濃度下，與探針?lè)跤?span style="font-family: Calibri;">2-3天后未觀察到對(duì)細(xì)胞活力的影響

4. FLIM成像：使用標(biāo)準(zhǔn)的FLIM顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像，使用485 nm或488 nm脈沖激光進(jìn)行激發(fā)，并通過(guò)600/50 nm帶通濾光片收集光子。我們建議優(yōu)化標(biāo)記程序以及圖像采集設(shè)置，以盡量減少488 nm激發(fā)光對(duì)活樣本的光損傷。為了提取壽命信息，將感興趣區(qū)域（ROI）或單像素（積累足夠計(jì)數(shù)以確保良好統(tǒng)計(jì)）的光子直方圖擬合為雙指數(shù)，并提取兩個(gè)衰減時(shí)間τ?和τ?。具有較高擬合振幅的長(zhǎng)壽命τ?用于報(bào)告膜張力，其值在2.8至7.0 ns之間。壽命越長(zhǎng)，膜的張力越大。τ?的值較小（在0.5至2 ns之間），且擬合振幅較小，不太適合用于研究膜張力。可以使用參考文獻(xiàn)1中給出的校準(zhǔn)程序?qū)勖c絕對(duì)膜張力相關(guān)聯(lián)。

重要注意事項(xiàng)：

- 只能通過(guò)FLIM顯微鏡進(jìn)行膜張力測(cè)量，熒光強(qiáng)度或波長(zhǎng)不能可靠地報(bào)告膜張力。

- 隨時(shí)間變化脂質(zhì)組成的系統(tǒng)也可能導(dǎo)致Flipper-TR壽命的變化。

- FLIM成像是一種高級(jí)顯微鏡技術(shù)，需要配備適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)激光器、光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)和發(fā)射濾光片的商業(yè)或定制FLIM顯微鏡系統(tǒng)。建議客戶咨詢其儀器負(fù)責(zé)人或聯(lián)系顯微鏡制造商，以確保其系統(tǒng)能夠成像Flipper-TR的熒光和壽命。

文獻(xiàn)參考：

1) Colom A, et al: A fluorescent membrane tension probe. Nat Chem, 2018, 10:1118–1125 ().

2) Dal Molin M, et al: Fluorescent flippers for mechanosensitive membrane probes. JACS, 2015, 137:568-571.

3) Soleimanpour S, et al: Headgroup engineering in mechanosensitive membrane probes. Chem Commun (Camb) 2016,52:14450-14453.