譜系追蹤技術猶如一把解鎖生命奧秘的“時光機”，通過為每個細胞賦予 的“條形碼”，記錄并分析這些信息，構建出細胞家族的“族譜”——細胞譜系樹。該技術能夠追溯生物體內每個細胞的起源與分化歷程，揭示細胞從胚胎發育到成熟個體的動態演變過程。這項技術不僅清晰展現了細胞間的親緣關系，還記錄了它們在時間和空間上的動態變化，為深入理解發育、疾病和再生等生命過程提供了關鍵線索，其應用場景包括發育生物學、腫瘤研究、免疫學和再生醫學等。隨著單細胞測序等高新技術的不斷發展，目前常見的譜系追蹤技術主要有如下幾種：

表1.常見譜系追蹤技術原理及特點

近日，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院彭廣敦研究團隊的最新突破，為譜系追蹤技術注入了新的活力。該團隊成功開發出新型單細胞譜系示蹤技術——DuTracer。該技術創新性地結合了CRISPR-Cas9和Cas12a兩種基因編輯工具，顯著提升了細胞譜系追蹤的精度和深度[3]。傳統的細胞譜系追蹤方法，因技術限制致使信息記錄不全，而基于CRISPR的基因編輯技術提高了分辨率，卻存在靶點間大片段刪除難題，如同在記錄家族歷史時丟失關鍵代際信息。DuTracer的創新之處在于同時利用Cas9和Cas12a兩種核酸酶，并通過控制它們的激活時間，避免多靶點同時編輯引發的示蹤信息丟失。實驗顯示，該技術在小鼠胚胎干細胞和類器官模型中大幅降低了有害刪除事件，且記錄的細胞分裂層級更深，能夠更精準地還原細胞分化路徑。

圖1.DuTracer設計原理

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Cas9 Nuclease來源于野生型釀膿鏈球菌S. pyogenes，是依賴RNA介導的內切核酸酶，可以特異地切割雙鏈DNA（在DNA PAM存在的情況下，也可以切割單鏈DNA或單鏈RNA）。Cas9切割位點位于目標序列內，離PAM（NGG）區3個堿基。本產品經過密碼子優化及核定位信號（NLS）設計，由大腸桿菌重組表達而來，編輯效率高，可用于細胞（造血干細胞、T細胞等）的基因修飾，也可用于分子診斷，檢測病原體等。

A：體外切割測試：3批次體外切割活性均達98%以上；

B：體內基因敲除，敲除效率與進口品牌一致。

圖2.Cas9 Nuclease體外切割活性及基因敲除效率結果

ArCas12a核酸內切酶，源自Agathobacter rectalis細菌的CRISPR系統，別名Cpf1，是一個包含1263個氨基酸的單體蛋白。Cas12a缺乏HNH結構域，可單獨利用其RuvC結構域在CRISPR RNA（crRNA）引導下識別位于靶標核酸5’端富含胸腺嘧啶（T）的PAM區而啟動對靶標DNA的切割，已成功用于許多哺乳動物和植物的基因組編輯。此外Cas12a還具有反式切割活性，可不加選擇地切割反應體系中的非靶標單鏈DNA。與LbCas12a/AsCas12a相比，ArCas12a具有更高的溫度適應性（25-55℃），可適用于基因組編輯及核酸檢測等。

圖3.ArCas12a順式切割活性檢測 M：Marker；C：模板雙鏈DNA

注：在crRNA的引導下可高效的切割雙鏈DNA（600 bp）產生兩段切割產物（200 bp+400 bp）

圖4.ArCas12a反式切割活性檢測

注：以雙鏈DNA模板為靶標，加入ArCas12a、crRNA（存在與模板DNA序列互補的spacer區）及單鏈DNA報告探針（含有熒光報告基團）進行體外切割，當ArCas12a與crRNA及靶標DNA形成復合體后會激活反式切割活性，切割單鏈DNA報告探針，從而發出熒光。結果顯示，翌圣ArCas12a與crRNA及模板DNA形成復合體后具有反式切割活性，可剪切單鏈DNA。

AapCas12b核酸酶（又名C2c1）是由tracrRNA:crRNA（或sgRNA）介導的DNA核酸內切酶，來源于嗜酸耐熱菌Alicyclobacillus acidophilus，在靶標雙鏈DNA存在PAM（TTN）序列的情況下，特異地剪切靶標雙鏈DNA，使DNA雙鏈斷裂并生成粘性末端。AapCas12b可不依賴PAM序列特異地剪切單鏈DNA靶標。雙鏈或單鏈DNA靶標均能激活AapCas12b的反式剪切活性（即旁路剪切活性/附屬剪切活性），即當AapCas12b酶與sgRNA、靶標DNA結合形成三元復合物后，便會被激活針對非特異序列ssDNA的反式剪切活性，將體系中的任意序列ssDNA切碎。AapCas12b最佳剪切反應溫度為60℃，比AacCas12b更耐高溫，適用于與LAMP聯用，開發恒溫擴增/CRISPR-Cas檢測體系。

圖5.AapCas12b Nuclease (10 μM)順式切割活性驗證

注：在20 μL的反應體系，含有帶PMA序列的雙鏈Target DNA、sgRNA、Cas12b和1×reaction buffer，在60°C下反應30 min，85°C下滅活5 min，在瓊脂糖凝膠電泳測定結果顯示，三批次AapCas12b Nuclease (10 μM) (Cat#14808ES)均能有效切割雙鏈Target DNA,切割效果與進口品牌T*相當。

圖6.AapCas12b Nuclease (10 μM)反式切割活性驗證

注：在20 μL的反應體系，含有帶PMA序列的雙鏈Target DNA、sgRNA、Cas12b、Report ssDNA熒光探針和1×reaction buffer，在60℃反應1h，每30 sec采集一次熒光信號，結果顯示在Target DNA、sgRNA、Cas12b共同存在的情況下，Report ssDNA熒光探針能被切割，從而釋放熒光信號。

該試劑盒的應用極為簡便，用戶只需設計一條特定的上游引物，并結合試劑盒提供的其他試劑，即可在短短4小時內合成出20-100 μg高品質的sgRNA。所產生的sgRNA具備高產量、高純度和高活性等優勢，在基因編輯過程中能顯著提升編輯效率，并大幅降低脫靶現象的發生幾率，確保基因編輯工作以高效率和高準確性進行。

圖7.不同時間的sgRNA的合成量

圖8.不同序列的sgRNA的合成產量

圖9.合成的sgRNA的純度（安捷倫2100測定）

圖10.sgRNA的剪切效率效果圖

當前，CRISPR基因編輯技術正處于快速發展的時期，整個領域仍在不斷成熟和完善中。隨著科學研究和技術應用的持續推進，我們有理由相信未來將涌現出更多創新性的基因編輯工具，這些新工具將進一步拓寬該技術的應用場景與潛力。

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參考文獻：

[1] Kretzschmar K, Watt F M. Lineage tracing[J]. Cell, 2012, 148(1): 33-45.

[2] Hsu Y C. Theory and practice of lineage tracing[J]. Stem Cells, 2015, 33(11): 3197-3204.

[3] Chen C, Liao Y, Zhu M, et al. Dual-nuclease single-cell lineage tracing by Cas9 and Cas12a[J]. Cell Reports, 2025, 44(1).