一、菌種代碼的意義

國內常見微生物檢驗所用的菌種代號是：

CMCC（F）或 CMCC（B）

CMCC —— 中國醫學菌種保藏中心

B —— 代表細菌

F ——代表真菌

大腸桿菌：CMCC (B) 44102；

乙型副傷寒沙門桿菌：CMCC (B) 50094；

銅綠假單胞菌：CMCC (B)10104；

金黃色葡萄球菌：CMCC (B)26003；

生孢梭菌：CMCC(B)64941；

白色念珠菌：CMCC(F)98001。

二、菌種的復蘇

按照菌種的使用說明將復蘇液在超凈工作臺或生物安全柜內進行復蘇。

三、常用菌種保藏方法

1、瓊脂斜面低溫保存法

（1）方法：將經常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養基）上，按規定的溫度和時間培養，待充分生長后，把培養好的新鮮菌種用牛皮紙包好，為減緩培養基的水分蒸發，延長保藏時間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3個月傳代一次。若用半固體高層培養基穿刺培養，一般可保藏半年至一年。

（2）適用范圍：細菌、酵母菌、霉菌保藏。

（3）特點：優點是簡便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養基；對大多數微生物都適用；缺點是保藏期太短；傳代次數多，易發生變異及污染。

（4）注意事項：

a.保藏的菌種應是生命活力旺盛的新鮮培養物，至少應是第三代的培養物。

b.保藏時，破傷風桿菌可用庖肉培養基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養基。必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動或生霉，如有異常應及時處理。

c.每次移植后，應與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養基特征和純度無誤后再繼續保藏。

d.保藏菌種的培養基應無糖，其他菌類含糖小于 2 %為宜，以免產酸過多，影響菌種存活。

e.銅綠假單胞菌在冰箱中易發生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。

2、液體石蠟保存法

（1）方法：將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~0.5 %瓊脂半固體高層培養基中，培養好備用。取化學純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或 110~ 170 ℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干燥器內除去液體石蠟中的水分。

將上述液體石蠟加入培養好的菌種試管內，液體石蠟液面以高出培養基最上端1cm為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。

（2）適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細菌保藏效果較差。

（3）特點：本方法簡便易行，是實驗室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。

（4）注意事項：

a.保藏時，用新鮮培養物接種，應檢查純度和特征后，方可進行保藏。

b.使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養物接種到新鮮斜面上培養，待長出新培養物后，再移種一次到新斜面上即可使用。

c.將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時，液體石蠟四濺，引起污染.

d.液體石蠟在菌種管中高出培養基的高度要嚴格控制，如太多，會影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1cm為宜。

e.制備無菌液體石蠟時，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養基中易造成污染。

3、磁珠保存法

將菌液浸入素燒磁珠(或多孔玻璃珠)后再進行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無水CaSO4)，上鋪玻璃棉，再放上10~20粒磁珠，經干熱滅菌后，接入菌懸液，最后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。

本法對酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長達兩年半時間。

磁珠保存時間更長，使用方便，大大減輕操作人員的工作。

四、常用菌種保藏方法

方法一：斜面傳代

冰箱取出的菌種斜面，應在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入超凈工作臺或生物安全柜。

點燃酒精燈（滅菌器），用左手握住菌種斜面，將管口靠進火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。左手將管口在火焰上旋轉燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住試管塞，撥開試管塞，將接種環伸入管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。

堵上試管塞，左手將菌種管放下，取營養瓊脂斜面1支，照上述操作打開試管塞，將接種環伸入管內至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環輕貼斜面的表面曲折移動，使細菌劃在斜面的表面上。

取出接種棒，在火焰旁將試管塞堵上，然后將接種棒在火焰上燒灼滅菌。

將已接種完的斜面置35~37℃培養22~24小時，霉菌管一般置20~25℃霉菌培養箱內培養7日。取出后放人冰箱保存，一般 3個月轉種一次。

 方法二：斜面-營養肉湯-分離平板-斜面

用接種環取上述斜面菌苔少許接種置營養肉湯中(5ml/支，已滅菌)，置35~37℃培養18~24小時后，再用接種環取培養好的營養肉湯菌懸液，接種于分離平板，置35~37℃培養18~24小時，用接種針選典型菌落劃線于營養瓊脂斜面，置35~37℃培養18~24小時。一般同時接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養基中，其它用做工作菌種。

常用分離平板：

大腸埃希菌——EMB瓊脂平板；

銅綠假單胞菌——溴化十六烷三甲銨瓊脂培養基；

金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養基。

五、菌種保管

菌種保管應有專人負責，雙人雙鎖，確保菌種安全。

菌種領用、傳代、保存都要有記錄，包括名稱、入庫、領用、傳代日期、鑒定者、主要鑒定性能及滅活或銷毀情況。

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