一、實驗原理

細胞凍存隨著溫度降低，細胞內的酶活性會逐漸降低，到-80℃左右，酶活性幾乎為0，代謝活動停止，可以實現長期保存。然而，隨著溫度降低，細胞內外的水分也會“結冰”并形成冰晶，冰晶能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。因此常加入冷凍保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點，延緩凍存過程，同時增加細胞膜的通透性，提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成，從而達到保護細胞的目的。

二、實驗前準備

1.細胞：選擇處于對數生長期（一般密度為80%-95%，不要使細胞長得過密）、狀態良好且無污染的細胞進行凍存。在凍存前一天，更換新鮮的全培養基，確保細胞處于最佳生長狀態。

2.培養基：準備適量的細胞培養所用的全培養基，根據細胞類型確定其配方，如 RPMI-1640、DMEM 等，并添加10%的胎牛血清（FBS），根據細胞不同，血清濃度可能會有變化，具體以培養細胞時需要的血清濃度為準。

3.凍存液：

（1）一般使用含有 90% 全培養基 和 10% 二甲基亞砜（DMSO）的凍存液。DMSO 需提前預冷至 4℃以下，且要確保其質量和純度，避免對細胞造成損傷。將凍存液在冰上或 4℃冰箱中配制，輕輕混勻。

（2）使用商品化的細胞凍存液，凍存液使用前保存在4℃冰箱。

4.凍存管：選用無菌、無 DNase 和 RNase、耐低溫的凍存管。在凍存管上清晰標記細胞名稱、凍存日期、細胞代數等重要信息，以便后續識別和使用。

5.水平離心機：確保離心機的轉速和離心力準確可靠，能夠達到 1000 - 1500 rpm 的轉速，用于細胞沉淀收集。提前清潔和消毒離心機轉頭及離心管套筒，防止交叉污染。

6.其他耗材：準備無菌的移液槍及配套槍頭，不同量程的移液槍應經過校準且在有效期內。槍頭需為無菌、無熱原的一次性耗材，避免對細胞產生污染。同時，準備適量的 PBS 緩沖液用于細胞洗滌，PBS 緩沖液需提前預熱至 37℃。

三、操作步驟

1. 細胞收集：

1）.以T25瓶為例，在超凈工作臺中，先將培養瓶中的舊培養基輕輕吸出，用預熱至 37℃的 PBS 緩沖液緩慢沖洗細胞 2 - 3 次，每次沖洗時 PBS 緩沖液的用量以能覆蓋細胞單層為宜，一般為 5 - 10 ml。沖洗的目的是去除殘留的培養基和血清，減少其對后續凍存過程的影響。

2）.然后加入適量的胰酶-EDTA 溶液（根據細胞類型和培養瓶大小確定用量，一般 T25培養瓶加入1 ml）

3）.將培養瓶置于 37℃培養箱中消化 1 - 5 分鐘。在消化過程中，需密切觀察細胞形態變化。當細胞開始變圓、收縮并逐漸從培養容器底部脫離時，用手輕輕拍打培養容器的側壁，幫助細胞全脫落。不同細胞類型的消化時間會有所不同，例如，一些上皮細胞可能需要3-5分鐘左右，而一些成纖維細胞可能需要2-4分鐘左右。

4）.用移液槍輕輕吹打細胞懸液，使細胞充分脫離培養瓶底部并分散均勻，避免產生過多氣泡。將細胞懸液轉移至15 ml離心管中。

2. 細胞計數與離心：

1).取少量細胞懸液，使用血細胞計數板或細胞計數儀進行細胞計數，計算細胞濃度和活率。

2).根據細胞濃度、活率和所需凍存的細胞數量，調整細胞懸液體積；一般凍細胞的密度為1×10^6 - 5×10^6個/ml。

3).將離心管放入離心機中，設置轉速為1000 rpm，離心5分鐘。

4).離心結束后，小心取出離心管，將其置于超凈工作臺中，緩慢吸出上清液，盡量避免吸到細胞沉淀。

3. 凍存液重懸細胞：

1).根據細胞沉淀的量，加入適量預冷的凍存液，一般按照1×10^6 - 5×10^6個/ml細胞密度進行重懸。

2).用移液槍輕輕吹打細胞沉淀，使細胞均勻分散在凍存液中，確保細胞密度適中，避免細胞團聚。

3).重懸后的細胞，盡量減少細胞存放于室溫的時間，盡快進入凍存階段。

4. 細胞分裝與凍存：

1).將重懸后的細胞懸液分裝至標記好的凍存管中，每管分裝的細胞懸液體積一般為 1 - 1.5 ml。在分裝過程中，要注意避免產生氣泡，同時確保凍存管密封良好。

2).由于使用的凍存方式不同會有不同的凍存方法，請選擇合適的凍存步驟。

a. 使用傳統方法：將凍存管先放入 4℃冰箱中靜置60 分鐘，使細胞逐漸適應低溫環境。然后將凍存管轉移至 -20℃冰箱中放置2小時，接著再放入-80℃冰箱過夜。最后，將凍存管迅速轉移至液氮罐中進行長期保存。在轉移過程中，要盡量縮短凍存管在室溫及 -20℃以上環境中的停留時間，防止細胞受損。

b. 使用凍存盒：將凍存管放入4℃預冷的凍存盒（確保凍存盒已加滿或更新異丙醇）中，然后快速將凍存管轉移至-80℃冰箱過夜。最后，將凍存管迅速轉移至液氮罐中進行長期保存。在轉移過程中，要盡量縮短凍存管在室溫及 -20℃以上環境中的停留時間，防止細胞受損。

c. 使用細胞凍存液：將凍存管轉移至-80℃冰箱過夜，然后將凍存管迅速轉移至液氮罐中進行長期保存。在轉移過程中，要盡量縮短凍存管在室溫及 -20℃以上環境中的停留時間，防止細胞受損。