Mustard seed major allergen Sin a1 activates intestinal epithelial cells and also dendritic cells that drive type 2 immune responses

KWS：Mustard seed；Sin a1；intestinal epithelial cells；immune responses；dendritic cells

在過去的幾十年里，食物過敏的患病率急劇增加，這是一個重大的健康問題。腸道上皮屏障穩態受到其與微生物群和粘膜免疫系統以及來自外部食物成分的相互作用的高度調節。這種體內穩態的破壞會導致食物過敏。主要食物過敏原的內在特性可能有助于激活上皮細胞并驅動 2 型樹突狀細胞（DC）活化的發展，這是導致過敏免疫級聯反應的第一步。

許多經常食用的食物，如披薩和番茄醬，都含有芥菜籽作為增味劑。在臨床水平上，大多數對芥菜籽過敏的患者對 Sin a1 敏感，該蛋白屬于過敏原中的一個大家族—2S 白蛋白家族，花生、堅果、豆類、芝麻都有相似的蛋白。先前的研究報道了不同的 2S 白蛋白能夠穿過腸道細胞單層，而不影響通透性，同時激活這些上皮細胞以產生免疫介質。然而，目前尚不清楚這是否會引起 Sin a1 的上皮激活，從而導致食物過敏。

因此，在荷蘭烏得勒支大學理學院藥理學系、西班牙康普頓斯大學生物化學和分子生物學系團隊的一項研究中，使用人腸道上皮細胞（IECs）分析了 Sin a1 通過腸粘膜的致敏能力，同時利用共培養系統進一步確定 Sin a1 暴露是否可以驅動先天性和適應性免疫細胞中的 2 型表型。研究成果發表在 Food & Function 期刊題為“Mustard seed major allergen Sin a1 activates intestinal epithelial cells and also dendritic cells that drive type 2 immune responses”。

食物過敏原與腸上皮屏障的相互作用被認為是口腔致敏的第一步。首先，在人結腸癌細胞系 HT-29 和/或Caco-2中研究了暴露于純化 Sin a1 后的上皮細胞的活化和屏障完整性（圖1 A）。為了確定上皮活化，測量了細胞因子（IL-33和TSLP）和趨化因子（CCL20和CCL22）的存在，這些因子參與DC和/或啟動DC來刺激Th2細胞發育，驅動2型免疫反應。此外，IL-8 也作為一般炎癥反應的標志物。

HT-29 細胞暴露于濃度遞增的 Sin a1（圖1 B），發現Sin a1 以劑量依賴性方式增加 CCL20 和 IL-33 濃度，而 CCL22 和 IL-8 不受影響，未檢測到 TSLP（圖1 C）。此外，Sin a1 不影響細胞活力，YMSE 和 LPS 都不像 Sin a1 一樣誘導上皮活化成 2 型。62.5 μg ml?1 的YMSE 誘導了 HT-29 細胞分泌 IL-8。

Caco-2 細胞暴露于不同濃度的 Sin a1，發現過敏原的存在不會影響細胞活力。最高劑量的 Sin a1 增強了 IEC 釋放的 CCL20，而 5 μg mL 的Sin a1使 IL-33 水平增加。CCL22 未觀察到顯著變化，TSLP 和 IL-8 均未檢測到。

這些結果表明，Sin a1 能夠相互作用并激活上皮細胞以啟動促過敏性免疫反應。由于在 HT-29 中，Sin a1 劑量依賴性地增加了 IL-33 和 CCL20，因此選擇這些細胞使用 25 μg mL-1 的劑量進一步研究 Sin a1 激活上皮細胞對 DC 成熟和下游 2 型極化的影響。

圖1    Sin a1 與 IEC 的相互作用。

通過胃腸道致敏的下一步是募集抗原呈遞細胞，如 DCs。上皮介質可能會將 DC 功能修飾為 2 型驅動表型，一旦過敏原被捕獲，它們就會遷移到淋巴結并將其呈遞給初始 T 細胞，從而驅動2 型免疫反應的極化。為了模擬這個過程，研究建立了一個共培養模型。HT-29 與 DC（IEC-DC）共培養或DC 單獨培養，這兩種情況均暴露于單劑量的 Sin a1 （圖2 A）。48 小時后，對來自基底外側腔室的靶細胞因子的分析顯示，在頂部腔室存在或不存在 HT-29 的情況下，免疫激活同時具有 2 型和 1 型表型（圖2 B）。Sin a1 增加 IL-25、CCL20 和 IL-15 水平。無論 Sin a1 是否存在，IEC 降低了 CD86 在 DC 中的表達，而 CD80 的表達趨于增加（圖2 C）。在存在或不存在 IEC 的情況下，與培養基對照相比，Sin a1 不影響 DC 的 OX40L、CD86 和 CD80 表達。與培養基對照相比，使用 LPS（DC1）或細胞因子混合物（DC2）的成熟對照組顯示OX40L 和 CD80 增加，CCL20 和/或 CCL22 分泌增加。

圖2    暴露于 Sin a1 的 DCs 及其與 HT-29（IEC-DC）的共培養。

接下來，致敏階段進入 DC 與 T 細胞的相互作用。因此，將同種異體原始 T 細胞與DC 共培養（圖3 A），并測定細胞因子譜和 T 細胞表型。細胞因子分析顯示，當 IEC-DC 或 DC 在前一步暴露于 Sin a1 時，IEC-DC/T 細胞和 DC/T 細胞中 IL-4 表達顯著增加（圖3 B）。IL-10 遵循類似的趨勢。流式細胞術顯示，當 IEC 暴露于 Sin a1 時，來自 IEC-DC/T 細胞的 T 細胞中 IL-13 表達顯著增加。此外，直接暴露于 Sin a1 的 DCs 傾向于增加 T 細胞上 CRTH2（Th2 標志物）的表達，而 CXCR3（Th1 標志物）的表達降低 （圖3 C）。此外，在這種情況下，MFI CRTH2/MFI CXCR3 的比率顯著增加，在 DC2/T 細胞對照中也是如此，表明平衡向 Th2 型轉移（圖3 C）。

這些數據表明，在 2 型免疫環境中，Sin a1 激活上皮細胞引發 DC 及其與 T 細胞的相互作用。

圖3    Sin a1 誘導的 IEC-DC 或 DC 與初始 T 細胞共培養可產生 2 型免疫反應。

為了研究 Sin a1 是否也引發體液免疫反應，將上一步中的 T 細胞與來自自體供體的 B 細胞共培養，測定 IgE 和 IgG 水平，以及 B 細胞表型（圖4 A）。共培養后，在 Sin a1-IEC-DC-T/B 細胞或 Sin a1-DC-T/B 細胞上清液中未觀察到 IgE 水平的顯著變化（圖4 B）。然而，當 IEC-DC 或 DC 暴露于 Sin a1 時，第 4 天和第 18 天的 B 細胞上清液中 IgG 水平顯著增加（圖4 B）。此外，雖然在第 4 天和第 18 天可以在 T/B 細胞共培養上清液中測量 IL-13，但僅在共培養 18 天后在上清液中檢測到 IL-4，并且在 Sin a1 條件下兩種細胞因子的水平不受影響。不同組間的 B 細胞表型（CD25、CD27 和 CD38 表達）不受影響（圖4 C）。當 B 細胞與 DC2 觸發的 T 細胞共培養時，不會影響 IgE 或 IgG 的分泌，也不會影響 B 細胞的成熟（圖4 A-C）。暴露于抗-IgM 或 IgE 混合物（抗-IgM + 抗-CD40 + IL-4）的對照 B 細胞傾向于增加IgE 釋放，并顯示 CD25 或 CD27 表達增強。

最后，將從 IEC-DC-T/B 細胞和 DC-T/B 細胞共培養物中獲得的上清液暴露于原代人干細胞衍生的肥大細胞（MCs）過夜，以確定上一步中 B 細胞產生的抗體介導的效應細胞活化。結果顯示，Sin a1 暴露于 IEC/DC 或 DC 以驅動免疫級聯反應，導致 MC 激活，如 2 型細胞因子分泌所示。這些結果表明，暴露于 IEC-DC-T/B 或 DC-T/B 的 T/B 細胞上清液 Sin a1 在抗-IgE 刺激下誘發肥大細胞活化。

圖4     Sin a1 暴露的 IEC-DC 或 DC 引發的 T 細胞與初始 B 細胞的共培養。

總之，芥菜籽過敏原 Sin a1 被證明可增強 IECs 和 DCs 的 2 型激活，導致 T 細胞的 2 型免疫反應和 B 細胞的體液免疫反應，促進 MC 激活，導致 IL-4 和 IL-13 釋放。該研究可能有助于更好地了解致敏過程，同時能夠探索食物過敏預防和治療的方法。

參考文獻：Bueno-Díaz C, Zuurveld M, Ayechu-Muruzabal V, Korsten SGPJ, Martín-Pedraza L, Parrón-Ballesteros J, Redegeld F, Garssen J, Villalba M, Willemsen LEM. Mustard seed major allergen Sin a1 activates intestinal epithelial cells and also dendritic cells that drive type 2 immune responses. Food Funct. 2024 Jun 17;15(12):6488-6501. doi: 10.1039/d4fo01980f. PMID: 38804660.

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