一、要樹立科學必須真實的觀念，實驗態度要端正。

要懷著一顆為了出具真實、準確，可信數據而敬畏的心去申請能力驗證。

實驗要求科學嚴謹,實驗要預先充分練習和實踐。能力驗證是對實驗室綜合實驗水平（人員，設備，環境等多因素）的評價。

首先要選好實驗項目，找到與之配套的方法，進行充分的方法驗證，從檢測員能力，儀器設備性能，校檢結果是否能滿足實驗需要，實驗檢測多次實驗，檢測環境是否進行了充分的考慮，實驗確認好實驗項目，認真學習標準，理解標準，并做到標準所規范的步驟，并對自己實驗有了一定的信心后再去申請能力驗證為宜。

舉例：某實驗室未經過充分實驗方法確認，實驗平時做的也少，直接申請了能力驗證。實驗過程生疏，照方抓藥，手忙腳亂，造成稀釋梯度不夠，平板干燥，菌落蔓延，無法出具具體數值，實驗失敗。

二、實驗室收到盲樣菌株標本后，首先應做的事情。

1、檢查標本的性狀和確認包裝情況，然后按照要求去能力驗證網站提交收到樣品情況。

2、仔細閱讀參指導書，包括標本如何保存的信息，進行實驗室內部工作分配，明確工作任務和要求。

3、實驗前應嚴格按照作業指導書的要求制訂檢驗流程，認真做好準備工作，包括實驗中需要使用的器皿，須提前做好清潔滅菌。

三、能力驗證樣品處理。

1、定量項目，西林瓶內樣品不可分割，應全部用于檢測。一般參考書指導的是加40mL稀釋液制成40mL樣品。

2、定量項目樣品稀釋。指導書標明了稀釋范圍的，在稀釋范圍左右各加1個稀釋度進行；書上沒有稀釋范圍的，多做稀釋倍數，選擇合適的稀釋倍數計數（一般可稀釋至10-8）。

3、定量項目，除了要多做稀釋倍數外，同時同一稀釋度要多倒幾皿，從原理上來講，檢測過程屬于隨機抽樣檢查，平板越多，數據越接近真值?？紤]性價比，又不可能一直一個稀釋度很多平板，所以能力驗證時候多倒幾皿，求好結果。

4、定性項目有一些重要步驟。

a、增菌及分離步驟尤其重要。選擇合適的增菌液和分離用培養基對目標菌的檢出非常關鍵，選擇兩種以上的增菌液和分離用培養基對菌株作直接分離和增菌后分離。

b、劃線分離十分重要，要把增菌液中的目標菌盡量多的表達出來，要分出單個菌落并盡可能多挑取可疑菌落，確保分離到目標菌。

c、生化試驗和血清學試驗以營養瓊脂平板上的純培養細菌為好。

四、實驗過程一定要做陰陽對照，全程空白對照。

再厲害的高手也有失手和看走眼的時候，所以陰陽對照就是一面鏡子。對于一些熒光染色后進行判讀的實驗顯得尤為重要。

這里掃盲一個誤區，定量計數測菌數時，我們會認為空白就是直接取1mL無菌水然后加入到平板里，然后混菌倒皿，這是錯誤的。因為這樣做的話，只能模擬證明稀釋后倒平板這一步有沒有污染。而無法證明從樣品稱取-樣品稀釋時候的污染質控情況。所以要做全程空白對照。

全程空白的含義就是把無菌液當成樣品，然后走一遍實驗過程。如果嚴格這么做的話，又會走向另一個，所以全程空白只從取樣開始至稀釋10-1做了簡化，而不做后續稀釋空白樣的混菌實驗。

在有些其他實驗時候，會有樣品空白以及稀釋液空白，比如大氣環境NOx和SO2的檢測，有興趣的可以去看看，對于全程空白的意義理解有更好的幫助。

五、培養基方面需要注意的地方。

1、培養基配制充分混勻后再滅菌。

正確做法是用一部分水攪拌均勻后，再加入剩余水量，混勻后滅菌或分裝。

2、混菌法倒皿要充分混勻。

培養基倒完要左5圈右5圈（混勻速度一定要慢，目的是——避免培養基波動到二皿接觸的縫隙部分造成后續污染），找較水平位置冷卻凝固。

3、培養基要不要覆蓋問題。

覆蓋的目的是為了阻止活菌在培養基表層通過鞭毛移動，造成片狀生長，無法計數這一不利現象的發生。這里可以發揮主觀能動性-對于不運動的菌，可以不覆蓋，對于運動的菌覆蓋。

總結一下：

a長期檢測同一種樣品，不覆蓋并無蔓延現象，不覆蓋；長期檢測蔓延選擇了覆蓋，一直覆蓋。

b未知樣品，進行覆蓋和不覆蓋的比對實驗，然后決定以后同樣的樣品是否需要覆蓋。養成經驗。

c能力驗證實驗，覆蓋和不覆蓋的都做，不要吝惜那么一點點培養基或耗材，畢竟能力驗證實驗做的漂亮才是實驗室（是室而不是人！）能力的綜合體現。

4、培養過程防止平皿干燥。

培養過程中培養基可以倒的適當厚一些，比如25mL。培養箱底部接一個不銹鋼盆，裝上足量無菌水（沒有就去買幾瓶哇哈哈怡寶什么的水倒里面）。

5、培養完成要保留實驗平皿和其他相關材料。

作為能力驗證，原始記錄及實驗報告還沒出具完成，各種材料還是保留至數據出具后較好，便于出現問題現查原因，馬上補救。

題外話：很多檢測員等結果出了問題然后到網絡上來求救，結果一問平皿已經洗掉了，那就不知道是什么狀況了。有時候你問她她還會振振有詞的講：10-1，10-2都蔓延了，不洗掉干嘛，10-5，10-6沒長菌，不洗掉干嘛？我當時真的無語，也不想多說話就沒繼續講了?，F在我回答一下這個問題：我要你一套完整梯度濃度的平皿，可以看出你10倍稀釋梯度是不是穩定，還有蔓延是個什么狀況，到底有多少，是一片還是局部還是很小一部分，然后根據整體數據估算結果（當然實驗做成這樣也基本算失敗了，因為實驗沒有做到你可控的范圍），是補救的一種（并不可取，屬于垂死掙扎）。定量實驗時，當天做完的稀釋樣品也要放冰箱里，雖然實驗要求不能復檢或重復檢測，但作為微生物專業你是知道菌放在2-8℃下并不會長多少，如果第二天一看數據有蔓延或疑問，馬上再做一次，這樣也應該在誤差范圍內出數。

6、實驗培養過程勤觀察。

微生物培養過程一般需要幾小時到幾十小時，要利用這段時間觀察培養箱及菌生長情況，比如溫度是否穩定，培養室內濕度如何等等，多思多看，準備預案。方有可能得到與盲樣一致的實驗結果。

原始記錄應有條理、思路清晰,完整準確地記錄菌株鑒定檢驗的全過程,原始記錄要包含時間、試驗現象、試驗結果三個要素，方便試驗出現問題的查找。

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