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顯微課堂 | 不可能的任務(wù)：可調(diào)顏色用于非掃描檢測(cè)
徠卡顯微系統(tǒng)的 4Tune 探測(cè)器是 SP8 DIVE 深度體內(nèi)探測(cè)器的關(guān)鍵組件，提供具有非掃描檢測(cè)的光譜可調(diào)圖像記錄，是多參數(shù)多光子顯微鏡的創(chuàng)新解決方案。
為什么要使用多參數(shù)顯微鏡？
生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熒光顯微鏡通常關(guān)注一系列不同顏色發(fā)射的相關(guān)性。不同的顏色代表特定染色的結(jié)構(gòu)或代謝參數(shù)。生物學(xué)是研究生物體的科學(xué)，而生物體即使在微觀尺度上也在運(yùn)動(dòng)。這一事實(shí)不僅適用于快速移動(dòng)的原生動(dòng)物，也適用于被認(rèn)為是靜態(tài)的個(gè)體，如植物。細(xì)胞區(qū)室、蛋白質(zhì)和代謝分子通常用不同顏色的熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。多光子顯微鏡增加了其他選項(xiàng)，如二次和三次諧波生成。這些顏色通道最好是同時(shí)記錄，即并行記錄，以保持它們?cè)诟叨葎?dòng)態(tài)變化的環(huán)境中的相關(guān)性。通過(guò)這種方式，同時(shí)記錄保留了被研究生物參數(shù)之間的時(shí)間和空間相互關(guān)系，并且提高了時(shí)間分辨率。這需要多個(gè)光傳感器用于不同的顏色通道，這些傳感器并行工作，并同時(shí)提供相關(guān)光譜的光的分?jǐn)?shù)。
替代方案是順序記錄，其中為不同的光譜分?jǐn)?shù)提供一個(gè)單一傳感器，依次記錄每個(gè)分?jǐn)?shù)的圖像并隨后疊加。使用順序方法，不僅可能會(huì)喪失空間和時(shí)間的相關(guān)性，而且時(shí)間分辨率也降低，降低的幅度至少等于記錄參數(shù)的數(shù)量。因此，整個(gè)數(shù)據(jù)采集所需的時(shí)間要長(zhǎng)得多：按相同的比例。
同時(shí)記錄光譜發(fā)射分?jǐn)?shù)的經(jīng)典解決方案是使用二色光束分割鏡和阻擋濾光片的排列。這種設(shè)計(jì)的缺點(diǎn)是，對(duì)于更改的染料組合，系統(tǒng)必須提供適當(dāng)?shù)臑V光配置，使其成為一種成本高、速度慢且不靈活的解決方案。
可調(diào)多波段檢測(cè)
對(duì)于單通道系統(tǒng)，這種不靈活性通過(guò)使用光譜設(shè)備——光譜儀被消除了。1997 年，徠卡激光技術(shù)公司推出了第一款具有自由可調(diào)檢測(cè)通道的多通道光譜設(shè)備，允許共聚焦顯微鏡同時(shí)記錄不同顏色的圖像：SP 探測(cè)器。[1]
該 SP 探測(cè)器解決方案用于共聚焦顯微鏡，采用一個(gè)棱鏡將檢測(cè)光分成其光譜成分，并通過(guò)一組級(jí)聯(lián)光譜儀狹縫將可調(diào)帶傳遞到傳感器。電動(dòng)屏障由反射鏡制成，因此可以將互補(bǔ)部分進(jìn)一步引導(dǎo)到傳感器上。通過(guò)這種方式，完整的光譜可以被切割成多個(gè)部分，每個(gè)部分可以進(jìn)行微調(diào)，以實(shí)現(xiàn)通道的最佳分離，而無(wú)需進(jìn)行復(fù)雜的計(jì)算。這個(gè)概念依賴于共聚焦顯微鏡中發(fā)射光束是靜止的這一事實(shí)。掃描運(yùn)動(dòng)通過(guò)掃描鏡進(jìn)行補(bǔ)償，發(fā)射的光以相反的方向經(jīng)過(guò)這些鏡子。然后，靜止的光束通過(guò)檢測(cè)針孔，生成光學(xué)切片。
然而，在多光子顯微鏡中，光學(xué)切片是通過(guò)光子的非線性相互作用產(chǎn)生的，這種相互作用在焦平面上具有足夠的密度。因此，不需要針孔，發(fā)射的光可以在通過(guò)掃描設(shè)備之前被檢測(cè)到，即非掃描檢測(cè)。這種方法對(duì)于成像深處的渾濁物體（如許多生物樣本）尤其重要，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出顯著的散射，導(dǎo)致光子損失。使用非掃描探測(cè)器，收集效率大大提高，圖像更加清晰，研究人員可以更深入地觀察標(biāo)本。然而，這一概念沒有靜態(tài)光束，這導(dǎo)致光譜在棱鏡和光譜儀狹縫上晃動(dòng)，從而導(dǎo)致位置依賴的光譜響應(yīng)。
漸變選項(xiàng)
到目前為止，非掃描探測(cè)器中各種發(fā)射通道的分離是通過(guò)二色鏡和具有固定光譜規(guī)格的阻擋濾光片來(lái)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置發(fā)生變化時(shí)，濾光片也需要更換。沒有辦法通過(guò)不斷改變?yōu)V光片參數(shù)來(lái)優(yōu)化性能。一個(gè)明顯的解決方案是用梯度元件替換光譜固定元件。與普通的二色分光器和濾光片不同，梯度元件在一個(gè)空間維度上具有光譜變化。簡(jiǎn)單的顏色漸變?yōu)V光片通常用于效果攝影，但也有高性能的介電濾光片和分光器。當(dāng)梯度濾光片在光束周圍移動(dòng)時(shí)，出射光束的光譜特性可以不斷調(diào)節(jié)。因此，梯度濾光片被隨意稱為“可變?yōu)V光片”。圖 1 展示了這一二色光束分割的原理，短通或長(zhǎng)通濾光也類似適用。
圖 1： 用作可調(diào)（可變）二色分光器的梯度二色器的性能。左：發(fā)射（E）通過(guò)可變二色分光器 VDS 分成兩個(gè)顏色帶。反射（R）到透射（T）的切換發(fā)生在較長(zhǎng)波長(zhǎng)（λ）處。右：當(dāng)移動(dòng) VDS 的位置時(shí)，R 到 T 的切換發(fā)生在較短波長(zhǎng)處。
我們只需要通過(guò)使用光譜的透射和反射部分制作這樣的漸變二色鏡的級(jí)聯(lián)，就可以同時(shí)記錄多個(gè)通道以進(jìn)行進(jìn)一步的分段。為了微調(diào)收集到的發(fā)射光，我們可以在探測(cè)器前放置一組可變的短通和長(zhǎng)通濾光片。
圖 2： 微調(diào)發(fā)射（E），例如通過(guò)可變帶通濾波器（VBF）減少串?dāng)_。左側(cè)：調(diào)諧到紅色波段。右側(cè)：調(diào)諧到藍(lán)色波段。帶邊緣是可單獨(dú)調(diào)諧的，因此中心頻率和帶寬也是可調(diào)的。
到目前為止，一切都很好。
但有新的挑戰(zhàn)
盡管我們可以通過(guò)梯度濾光片構(gòu)建一個(gè)具有可調(diào)光譜檢測(cè)通道的非掃描探測(cè)器，但掃描顯微鏡需要一個(gè)巧妙的設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)行設(shè)置。掃描光束的角度和位置變化以及梯度介電光學(xué)濾光片的特性導(dǎo)致了這種設(shè)計(jì)的需求。接下來(lái)的兩個(gè)部分將討論這兩個(gè)方面。
掃描顯微鏡
掃描顯微鏡的設(shè)計(jì)是將光點(diǎn)在焦平面上沿兩個(gè)方向（x 和 y）移動(dòng)。因此，光束在焦平面（圖 3 中的 F）或任何與場(chǎng)共軛的平面中的位置是不斷變化的，例如，中間圖像平面。
圖 3： 掃描顯微鏡中的光束特性由每束光線的主光線（主光線）a、b 和 c 顯示，這些光線穿過(guò)顯微鏡。光線 a、b 和 c 照亮了場(chǎng)平面 F 中的不同位置。它們通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為不同的角度，但在瞳孔平面 P 中位置固定。在 F 和 P 之間的平面 G 中，位置和角度都在變化。
在瞳孔平面（參見圖 3 中的 P），它與顯微鏡物鏡的后焦平面重合，位置是固定的，但角度隨著掃描過(guò)程不斷變化。這個(gè)關(guān)系被用來(lái)方便地掃描樣本，而不需要移動(dòng)標(biāo)本或光源。掃描鏡被放置在與后焦平面共軛的平面中。當(dāng)掃描時(shí)，鏡子改變光束角度，這會(huì)導(dǎo)致焦平面中的位置變化。
在任何像 G 這樣的平面中，位于 F 和 P 之間，角度和位置都隨著掃描而變化。
濾光器特性
不同設(shè)計(jì)的濾光器表現(xiàn)不同，具體取決于它們的位置和角度（見圖 4）。
1
色素濾光片：
對(duì)于傳統(tǒng)的顏色濾光片，通常是含有顏色顏料的玻璃片，光束通過(guò)濾光玻璃的位置對(duì)光譜性能沒有影響。當(dāng)以非垂直方式照射這樣的濾光片時(shí)，光在均勻材料中通過(guò)的距離變長(zhǎng)。因此，透過(guò)率降低。
圖 4： 不同設(shè)計(jì)概念的光學(xué)顏色濾光器的行為，取決于照明位置和角度。有關(guān)更多細(xì)節(jié)，請(qǐng)參見正文。
2
干涉濾光片：
由一個(gè)空的玻璃基板組成，表面涂覆有特定順序的介電材料層，因此也被稱為介電濾光片。這些層會(huì)導(dǎo)致通過(guò)的光線之間發(fā)生干涉。層的厚度和材料成分的組合使得過(guò)濾作用得以實(shí)現(xiàn)，允許光譜中所需的部分通過(guò)濾光片，而相應(yīng)的部分則被反射。未在垂直照明下操作的干涉濾光片可以收集傳輸和反射的部分。在這種情況下，濾光片被稱為二色鏡。對(duì)于均勻涂覆的濾光片和二色鏡，照明位置對(duì)傳輸光沒有影響。然而，入射角的變化會(huì)導(dǎo)致二色鏡的顏色發(fā)生顯著變化。通常它們?cè)诩s 45°的入射角范圍內(nèi)操作。對(duì)于在垂直入射下操作的干涉濾光片，變化可以忽略不計(jì)。
3
梯度干涉濾光片：
具有與均勻干涉濾光片相同的特性，但顏色響應(yīng)沿一個(gè)空間方向變化。因此，透過(guò)率依賴于入射角和在梯度方向上的位置。對(duì)于掃描顯微鏡來(lái)說(shuō)，這種解決方案似乎是最糟糕的，因?yàn)樵诠馐娜魏挝恢脪呙钑r(shí)，光譜特性都會(huì)發(fā)生變化。
因此問(wèn)題出現(xiàn)了：是否有辦法在非掃描光束路徑中使用梯度濾光片進(jìn)行多通道檢測(cè)，盡管存在所有這些顏色效應(yīng)？
問(wèn)題 + 問(wèn)題 = 解決方案
如果我們將梯度濾光片放置在與場(chǎng)共軛的平面中，那么由于變化的位置我們將會(huì)有顏色變化。在與瞳孔共軛的平面中，由于變化的角度我們將會(huì)有顏色變化。
但是，如果我們將濾光器放在一個(gè)合適的位置（圖 3 中的位置 G），并且如果我們合理設(shè)計(jì)濾光器涂層，那么我們可以使這兩種效果相互抵消 [2]。光束路徑和濾光器的設(shè)計(jì)計(jì)算有些繁瑣，但最終會(huì)得到一個(gè)實(shí)用的解決方案。這些結(jié)果是通過(guò)徠卡顯微系統(tǒng)的 4Tune 探測(cè)器實(shí)現(xiàn)的。
圖 5：4Tune 光譜非掃描檢測(cè)：樣品的發(fā)射（E）通過(guò)一組連續(xù)可變的二色分光器（VDS）在空間上分離成子光譜。最終信號(hào)分?jǐn)?shù)可以通過(guò)連續(xù)可變的帶通濾波器（VBF）進(jìn)行微調(diào)，然后由傳感器 1、2、3 和 4 接收。
徠卡顯微系統(tǒng)的 4Tune 探測(cè)器采用上述技術(shù)。SP8 DIVE 中集成了梯度二色鏡和濾光片，提供四個(gè)可自由獨(dú)立調(diào)諧的光譜通道，用于多光子顯微鏡中的非掃描檢測(cè)。用戶可以在直觀且整齊排列的圖形軟件界面中輕松定義所需的波段。該界面允許用戶在熒光中設(shè)置光譜波段，以獲得最佳效率和通道分離。它還允許在更改照明波長(zhǎng)時(shí)無(wú)縫調(diào)諧第二或第三諧波的檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行熒光記錄。
圖 6： 使用 4Tune 探測(cè)器的多光子顯微鏡拍攝的鼠皮膚切片圖像。Lgr5CreERT2-GFP 彩色斑點(diǎn)小鼠的小腸。灰色：SHG 信號(hào)（膠原蛋白 1），綠色：Lgr5+干細(xì)胞。紅色、藍(lán)色和黃色，追蹤的細(xì)胞是 Lgr5 干細(xì)胞的后代。樣本由荷蘭烏特勒支的 Jacco van Rheenen 提供。
參考文獻(xiàn)：
1.Engelhardt J: Device for the selection and detection of at least two spectral regions in a beam of light. World Patent WO 1995007447 A1, priority Sep. 8th (1993).
2.Gugel H, Neugart F and B?hm I: Scanning Microscope. World Patent WO 2016 / 198694 A1, priority June 11th (2015)
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