一、知識背景

SP6核糖核酸聚合酶也被稱為SP6 RNA聚合酶，是一種由大腸桿菌中的噬菌體SP6產生的酶。這種酶具有在體外合成RNA分子的能力，因此，它常被用于體外轉錄實驗，廣泛應用于合成特定的RNA分子。

SP6核糖核酸聚合酶的主要特點是能夠高度特異識別SP6啟動子序列，是一種DNA依賴的5'→3'RNA聚合酶。它催化單鏈或雙鏈DNA SP6啟動子下游NTP的摻入，合成與SP6啟動子下游的模板DNA互補的RNA。此外，SP6 RNA聚合酶還能識別修飾的NTP，例如生物素標記、熒光素標記的NTP，這使得它在各種標記RNA的合成中具有應用價值。

在科研實驗中，利用SP6核糖核酸聚合酶合成的RNA有多種應用，如制備雜交探針、進行基因組DNA序列分析、核糖核酸酶保護測定、反義RNA合成、作為體外翻譯的RNA模板、RNA剪接研究的底物、RNA二級結構和RNA-蛋白質相互作用研究，以及核酸擴增分析等。此外，它還可以用于合成siRNA、miRNA等小RNA。

值得注意的是，使用SP6核糖核酸聚合酶時，必須以SP6 DNA或克隆在SP6啟動子下游的DNA作為合成模板，并且該酶需要在特定的條件下儲存，一般是-20°C。

二、應用研究

SP6核糖核酸聚合酶可以用于FasL基因的克隆化及其mRNA在肺癌組織中的表達分布：

通過采用反轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)技術和分子克隆技術克隆人FasL基因片段，制備互補核糖核酸(cRNA)探針，采用原位雜交的方法觀察FasL mRNA在肺癌組織細胞中的表達分布情況，并探討其臨床意義。

方法：分離健康人外周血單核細胞(PBMC)，終濃度為50mM，用植物血凝素-P(PHA-P)激活15分鐘，誘導FasL基因表達，用人全血總RNA提取試劑盒(QIAamp RNA Blood Mini kit)提取總RNA，特異性引物反轉錄制備互補脫氧核糖核酸(cDNA)，聚合酶鏈反應擴增FasL基因片段，產物經瓊脂糖凝膠電泳，顯示在≈328bp處呈現1條與預期產物分子量大小相符的DNA擴增條帶，按照QIAquick凝膠提取試劑盒說明進行膠上PCR產物回收，予以擴增、純化，用PstI、EcoRI雙酶切PCR產物和質粒pSPT19，使PCR產物和質粒DNA兩端互補，用T4連接酶將其定向克隆入質粒中，轉化感受態大腸桿菌JM109，在涂抹有氨芐青霉素的LB平板上進行藍白篩選，獲取有重組質粒的陽性轉化子，插入的FasL cDNA經DAN測序證實與Genebank中FasL序列相同，用PstI酶酶切重組質粒，使之線性化，經SP6核糖核酸聚合酶體外轉錄制備標記的FasL cRNA探針(Dig-FasL cRNA)。收集青島大學醫學院附屬醫院胸外科手術切除的肺癌新鮮標本(經病理證實，其中鱗狀細胞癌3例，腺癌2例，小細胞癌1例)，置于無菌Ep管中，經液氮速凍運輸，轉移至-70℃冰箱中備用，標本經4％多聚甲醛和15％蔗糖處理后制備成冰凍切片，厚度為6μm，再經多聚甲醛后固定，非離子型去污劑處理細胞膜，在切片上用cRNA探針進行原位雜交，經四唑氮藍(NBT／BCIP)顯色，鏡下觀察FasLmRNA在肺癌細胞中的表達分布情況。結果：DNA測序證實重組質粒中插入的FasL cDNA序列準確無誤；標記的FasL cRNA探針經標記效率檢測，標記效率滿意；鏡下觀察發現三種病理類型的肺癌細胞胞漿中均可檢測到藍紫色雜交信號，表明肺癌細胞中存在FasL mRNA的表達。結論:FasL基因的克隆化成為肺癌細胞凋亡研究的工具;標記的FasL mRNA探針為進一步研究FasL mRNA在肺癌細胞中的表達分布提供了有效手段:FasL作為促細胞凋亡基因與肺癌的發生、發展有重要關系。

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