小鼠肺微血管內皮細胞構成半選擇性屏障,該屏障對于肺氣體交換,調節液體和可溶物在血液與肺間質之間的流動具有重要意義。它還具有代謝功能,可以執行一定的非呼吸功能。在肺損傷中,肺微血管內皮細胞是活性氧類的重要靶細胞之一。
在肺炎的發生過程中,神經體液介質和氧化劑作用于內皮細胞,使得細胞間隙滲透性增加,蛋白質由血液進入間質。細胞間隙滲透性的增加導致低氧血癥,出現成人呼吸窘迫綜合征和非心源性肺水腫。
小鼠肺微血管內皮細胞來源于實驗動物的正常肺組織,細胞為上皮樣,多角形細胞,貼壁培養,采用CD31免疫熒光染色鑒定為陽性,細胞純度高于90%,不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。
1.試驗所需儀器設備及試劑
(1)儀器
儀器名稱 | 規格型號 |
生物安全柜 | BSC-1500ⅡA2-X |
CO2細胞培養箱 | BC-J160S |
熒光倒置顯微鏡 | DS-Ri2 |
高速冷凍離心機 | Multifuge X1R |
電熱恒溫鼓風干燥箱 | DHG-9123A |
電熱恒溫震蕩水槽 | DK-2B |
(2)試劑耗材
試劑名稱 | 規格/貨號 |
T25細胞培養瓶 | 430639 |
血球計數板 | Neubauer improved |
24孔板專用細胞爬片 | YA0350 |
細胞培養孔板 | WHB-24 |
胎牛血清 | 1414426 |
內皮細胞培養基 | Primed-icell-002 |
0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA) | 1734858 |
2、小鼠肺微血管內皮細胞的分離培養
1) 將5-10d的乳鼠浸泡入75%乙醇中,移入生物安全柜,
2) 從胸部解剖乳鼠,取出雙肺置于預冷的PBS中,盡可能的除去結締組織等,
3) 取肺邊緣部分,剪碎,將組織塊移入T25培養瓶中,倒置于細胞培養箱中,
4) 2h后,培養瓶中注入2 mL內皮培養基,小心將培養瓶正置于培養箱,確保組織塊不會飄起來,
5) 每3d換液2mL,待細胞從組織塊中爬出來后,隔2d換液,待細胞融合達到60-70%左右時,去除組織塊,將肺微血管內皮細胞重新鋪瓶。
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