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實時熒光定量PCR儀主要由熒光定量系統和計算機組成。熒光定量系統負責監測PCR反應過程中的熒光信號，而計算機則負責收集、處理和分析這些熒光數據。數據通過開發的實時分析軟件以圖表的形式顯示，原始數據被繪制成熒光強度相對于循環數的圖表，便于后續的分析和解讀。
其工作原理基于在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光標記探針。這些熒光物質能夠隨著PCR反應的進行而發出熒光信號，其強度與擴增產物數量成正比。在PCR反應過程中，儀器通過熒光檢測系統實時測量熒光信號強度，從而監測PCR擴增的進程。
具體來說，PCR反應包括變性、退火和延伸三個步驟。在變性步驟中，DNA雙鏈被打開成單鏈；在退火步驟中，特異性引物與模板DNA的單鏈結合；在延伸步驟中，DNA聚合酶沿著引物延伸，合成新的DNA鏈。這三個步驟在PCR儀中通過準確控制溫度來實現循環進行，每個循環擴增的產物量呈指數增長。
根據所用熒光物質的化學原理和PCR檢測的特異性，可將實時熒光定量PCR儀分為兩大類：DNA染料法和熒光探針法。
1.DNA染料法：如SYBR Green I等熒光染料可以快速滲入DNA雙鏈與之結合，發射熒光信號，而不摻入雙鏈的熒光染料分子不會發射任何熒光信號，可以對特異性和非特異性的PCR擴增產物進行檢測。這種方法可檢測所有雙鏈DNA擴增產物，包括非特異反應產物，如引物二聚體，不需要探針，因此減少了實驗設計及運轉成本，適合于大量基因的分析，但缺點是易產生假陽性現象。
2.熒光探針法：可分為Taqman探針法和分子信標探針法。Taqman探針法是在PCR擴增時在加入一對引物的同時，再加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。當探針完整時，報告基團發出的熒光信號正好被淬滅基團吸收，體系中沒有光信號；隨著反應的進行，探針被Taq酶的5'-3外切酶酶切降解，使報告基團與淬滅基團分離，信號檢測系統接收熒光信號。分子信標是種由于堿基互補形成的莖環結構的寡核苷酸，由于熒光基團與猝滅基團靠得很近，熒光被淬滅。PCR擴增過程中隨著DNA雙鏈解鏈，信標的莖環與暴露的DNA靶序列雜交，互補區被拉開致使熒光基團和泮滅基團之間距離增加，熒光恢復。
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