角膜的主要結構為角膜基質層，占整個角膜厚的90％左右，在維持角膜高透明度和人眼正常視覺功能方面發揮著重要作用。人類角膜基質細胞是角膜基質中的主要細胞類型。它們在細胞外基質的分泌和組裝以維持角膜基質結構的高度排列以及角膜基質創面修復中都發揮著不可替代的關鍵作用。人類角膜基質細胞在受到機械創傷、病原體感染或藥物中毒的刺激后，會死亡或發生表型轉化，導致角膜水腫，嚴重的情況下，角膜會變得渾濁甚至失明。因此，探究人類角膜基質 細胞的結構和生物力學特性顯得尤為重要。

細胞的生物功能高度依賴于它與基底的相互作用。培養細胞時所用的基底不同， 細胞的形態和力學特性也會有所差異， 探索細胞-底物相互作用和細胞對力刺激的反應正日益成為細胞研究領域的一個重要課題，例如細胞粘附、變形、定向遷移、凋亡等。原子力顯微鏡（AFM）能夠在納米尺度上提取軟生物樣品的結構信息。此外， AFM可以通過測量角膜基質細胞表面的模量和捕捉形態學來確定離散的角膜層的局部機械性能。利用AFM的進展,如峰值力定量納米機械原子力顯微鏡,可以快速獲取樣品的力學性能。

天津理工大學天津市機電系統設計與智能控制重點實驗室王鑫老師團隊^[1]通過探究角膜基質細胞-底物之間的相互作用對細胞形態及力學特性的影響。將角膜基質細胞分別培養在三種不同硬度的基底上，三種基底分別為空白普通培養皿（硬基底）， 2D膠原上（鼠尾Ⅰ型膠 原蛋白包被的培養皿）， 3D膠原上（三維鼠尾Ⅰ型膠原蛋白的培養皿）， 通過布魯克生物型原子力顯微鏡（Bioscope）表征角膜基質細胞的形貌，并且利用AFM力曲線陣列模式獲得角膜基質細胞上選定區域的力-位移曲線， 通過模型擬合力-位移曲線獲得相應的彈性模量， 以此探究角膜基質細胞在不同基底上的力學特性。將角膜基質細胞置于細胞培養液中且保證液體溫度在37℃左右。待溫度穩定后，再進行樣本掃描，使用的AFM工作模式為Peak Force QNM in Fluid，得到角膜基質細胞的形貌圖，再利用AFM的force volume模式對已測得的細胞形貌區域內做力-位移曲線。將細胞壓痕保持在彈性范圍內。角膜基質細胞上所測得的典型力-位移曲線如圖1。

圖1.角膜基質細胞的單個力－位移曲線

在實驗過程中，通過測得的力-位移曲線，藍色曲線表示探針壓入細胞的過程，稱其為加載曲線，紅色曲線表示探針離開細胞表面的過程，稱其為卸載曲線。已知的量有探針對細胞施加的載荷Ｆ，針尖壓入細胞表面的深度δ，針尖半徑Ｒ，細胞的泊松比ν，通過曲線擬合就可以得到細胞表面的彈性模量值。

利用AFM采集到的三種不同基底上的角膜基質 細胞形貌如圖2所示。將采集到的細胞形貌圖像利用AFM離線分析后再經過軟件進行后處理分析，對圖像進行壓平處理，得到最后的角膜基質細胞的AFM形貌圖。

圖2.角膜基質細胞的AFM形貌圖

從圖2看出角膜基質細胞形態總體呈梭形形狀，而長在硬基底 圖2a上的角膜基質細胞形態呈梭形較長，且鋪展面積較小，在３Ｄ膠原圖2b上生長的角膜細胞生長形狀和鋪展面積均適中，而在２Ｄ膠原 圖2c 上的角膜細胞形態逐漸由梭形變為類似三角的形狀且鋪展面積也變大。

AFM 具有納米級的成像分辨率，可以在近生理條件下對細胞進行高分辨形貌成像和力學性能測量，利用AFM技術獲得不同硬度的培養基底上角膜基質細胞的形貌圖和角膜基質細胞的彈性信息，并對實驗結果數據進行分析。角膜基質細胞培養在不同硬度的基底上的形貌有所差別，培養在越軟的基底上，角膜基質細胞的形狀由在硬基底上的梭形逐漸變化為類似三角形狀，且鋪展面積變大。

原子力顯微鏡近年來成為研究細胞形貌和力學特性的一種新興的工具，在生物材料方面具有準確的活細胞定量力學性質成像、高分辨率的生物分子和細胞成像、動態生物過程的快速掃描等優勢，將獲取生物樣品中的物理結構、生化相互作用過程和力學性能信息變成可能。

◆ 使用電容傳感器技術的探針掃描方式

◆ PeakForce Tapping和QI模式，適用于針對精細樣品的高分辨率成像與高級力控制