鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)試劑盒
鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)試劑盒說明書
微量法 100T/96S
正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義:
脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同,分為谷氨酸( Glu) 和鳥氨酸( Orn) 兩條合成途徑。鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶( δ-OAT) 是 是以鳥氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶,對植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。
測定原理:
鳥氨酸和α-酮戊二酸在鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶和 NADH 作用下發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成吡咯啉-5-羧酸(P5C),同時產(chǎn)生NAD,通過檢測 340nm 處的吸光度的變化可反映出鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的高低。
組成:
產(chǎn)品名稱 | BH6016-100T/96S | Storage |
提取液:液體 | 110ml | 4℃ |
試劑一:液體 | 30ml | 4℃ |
試劑二:粉劑 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑三:粉劑 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑四:粉劑 | 2 瓶 | -20℃ |
說明書 | 1 份 |
試劑二臨用前加 8ml 試劑一充分溶解;用不完的試劑 4℃保存。試劑三臨用前加 8ml 試劑一充分溶解;用不完的試劑 4℃保存。試劑四臨用前每瓶加 4ml 試劑一充分溶解;現(xiàn)配現(xiàn)用。
自備儀器和用品:
天平、低溫離心機(jī)、研缽、酶標(biāo)儀、96 孔板。
酶液提取:
1、組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(ml)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g,加入 1ml 提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于 4℃,10000g 離心 10min,取上清置冰上待測。
2、細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個):提取液體積(ml)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)胞加入1ml 提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min);然后 4℃,10000g離心 10min,取上清置冰上待測。 3、液體:直接檢測。
測定操作:
1、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min,調(diào)節(jié)波長至 340nm。
2、將配好的試劑二、三、四 37℃預(yù)熱 5min。(注意:粉劑試劑需要自行配制)
3、取 96 孔板,依次加入 60μl 試劑二,60μl 試劑三,60μl 試劑四,20μl 粗酶液,充分混勻,記錄 340nm
處初始吸光值和 37℃反應(yīng) 10min 的吸光值A2,△A=A1-A2。
計(jì)算公式:
用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下
(1) 按照樣本蛋白濃度計(jì)算
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。 δ-OAT(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T
=321.54×ΔA÷Cpr
(2) 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活單位定義:每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。 δ-OAT(nmol/min /g 鮮重)=ΔA÷(ε×d)×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T
=321.54×ΔA÷W
(3) 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活單位定義:每 104 個細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。 δ-OAT(nmol/min /104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V 反總÷(V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總) ÷T
=321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量
(4) 按照液體體積計(jì)算
酶活單位定義:每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。 δ-OAT(nmol/min /ml)=ΔA÷(ε×d)×V 反總÷V 樣÷T
=321.54×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.2ml;ε:NADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96 孔板光徑, 0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.02ml;V 樣總:加入提取液體積,1ml;T:反應(yīng)時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;W:樣本質(zhì)量,g
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