RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)，也稱為逆轉錄PCR，是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技術。RT-PCR實驗需要追求一致性（穩定性），不管RNA上樣量如何，反轉錄的效率都保持一致，確保cDNA的差異能夠真實反映mRNA的差異。在進行RT反應之前，考慮以下幾個方面，可以更好地進行RT-PCR實驗。

一、增加反應體系的靈敏度：

1. 分離高質量RNA：

成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍/酸性酚的一步法。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品(如胰臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍體積的乙醇，室溫放置3-5分鐘，10,000×g離心5分鐘。

2. 使用無RNaseH活性(RNaseH-)的逆轉錄酶：

在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。

逆轉錄酶催化RNA轉化成cDNA。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。

SuperScriptⅡ逆轉錄酶，RNaseH- 的MMLV逆轉錄酶及thermoScript逆轉錄酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全長的cDNA。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響。ThermoScript比AMV的靈敏性強得多。RT-PCR產物的大小受限于逆轉錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。同MMLV相比，SuperScripⅡ顯著提高了長 RT-PCR產物的產量。RNaseH- 的逆轉錄酶同時增加了熱穩定性，所以反應可以在高于正常的37-42℃的溫度下進行。在建議的合成條件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的 [α-P]dCTP。第一鏈的總產量使用TCA沉淀法計算。全長cDNA使用在堿性瓊脂糖膠上將大小分類的條帶切除并計數的方法分析。

3. 提高逆轉錄保溫溫度：

較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開，增加了反應的產量。對于多數RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數二級結構，從而使引物可以結合。然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性后也是如此。對這些困難模板的擴增可以使用 ThermoScript逆轉錄酶，并將逆轉錄反應置于較高溫度下進行以改善擴增。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當使用基因特異性引物(GSP)進行cDNA合成時(見第三章)。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預計的保溫溫度相同。不要在高于60℃時使用oligo(dT)和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉到逆轉錄保溫溫度，并加入預熱的2×的反應混合物提高特異性(cDNA熱啟動合成)。這種方法有助于防止較低溫度時所發生的分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化 RT-PCR所需的多種溫度切換。

Tth熱穩定聚合酶在Mg2+存在條件下作為DNA聚合酶，在Mn2+存在條件下作為RNA聚合酶。它可以在最高65℃條件下保溫。然而，PCR過程中Mn2+的存在會降低忠實性，這使得Tth 聚合酶不太適合用于高精確度的擴增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆轉錄效率較低，這會降低靈敏度，而且，既然單個酶就可以進行逆轉錄和PCR，那么沒有逆轉錄的對照反應就不能用來將cDNA的擴增產物同污染的基因組DNA的擴增產物區分開來。

4. 促進逆轉錄的添加劑：

包括甘油和DMSO在內的添加劑加到第一鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩定并解開RNA二級結構，最多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。為了在SuperScriptⅡ逆轉錄反應中最大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10%的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉錄反應產物加入到PCR中，那甘油在擴增反應中的濃度為0.4%，這不足以抑制PCR。

5. RNaseH處理：

在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對于某些模板，據認為cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產生的信號。對于多數RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。

6. 小量RNA檢測方法的提高：

當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨后的沉淀。對于小于50mg的組織或106個培養細胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。

在使用SuperScriptⅡ的逆轉錄反應中加入乙酰化BSA可以增加靈敏度，而且對于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加入40單位的 RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進行逆轉錄反應時加入 BSA或RNase抑制劑。

二、增加RT-PCR特異性

1. CNDA合成：

第一鏈cDNA合成的起始可以使用三種不同的方法，各種方法的相對特異性影響了所合成cDNA的量和種類。

隨機引物法是三種方法中特異性低的。引物在整個轉錄本的多個位點退火，產生短的，部分長度的cDNA。這種方法經常用于獲取5'末端序列及從帶有二級結構區域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。為了獲得最長的cDNA，需要按經驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應體系。因為使用隨機引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用 poly(A)+RNA。

Oligo(dT)起始比隨機引物特異性高。它同大多數真核細胞mRNA 3'端所發現的poly(A)尾雜交。因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2%，所以與使用隨機引物相比，cDNA 的數量和復雜度要少得多。因為其較高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進行優化。建議每20μl反應體系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18適用于多數RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因為其熱穩定性較好，適用于較高的保溫溫度。

基因特異性引物(GSP)對于逆轉錄步驟是特異性好的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機引物或 oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設計PCR引物的規則同樣適用于逆轉錄反應GSP的設計。GSP可以同與mRNA3'最末端退火的擴增引物序列相同，或GSP可以設計為與反向擴增引物的下游退火。對于部分擴增對象，為了成功進行RT-PCR，需要設計多于一個反義引物，因為目的RNA的二級結構可能會阻止引物結合。建議在20μl的第一鏈合成反應體系中使用1pmol 反義GSP。

2. 提高逆轉錄保溫溫度：

為了充分利用GSP特異性的全部優點，應該使用有較高熱穩定性的逆轉錄酶。熱穩定逆轉錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應嚴謹性。比如，如果一個GSP退火溫度為55℃，那么如果使用AMV或M-MLV在低嚴謹性的37℃進行逆轉錄，GSP所帶有的特異性就沒有全利用。然而SuperScripⅡ和 ThermoScript可以在50℃或更高進行反應，這就會消除較低溫度時產生的非特異性產物。為獲得最大的特異性，可以將RNA/引物混合物直接從 65℃變性溫度轉移到逆轉錄保溫溫度，并加入預熱的2×反應混合液(cDNA合成熱啟動)。這有助于防止低溫時分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化 RT-PCR所需的多種溫度轉換。

3. 減少基因組DNA污染：

RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法，如Trizol Reagent，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。為了避免產生于基因組DNA的產物，可以在逆轉錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時所發生的依賴于鎂離子的RNA水解。

為了將擴增的cDNA同沾染的基因組DNA擴增產物分開，可以設計分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產物會比來源于沾染的基因組DNA 的產物短。另外對每個RNA模板進行一個無逆轉錄的對照實驗，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉錄時所得到的PCR產物來源于基因組。