前  言

慢病毒載體使得真核細胞基因修飾、表達變得更簡單，在實驗室研究、工業生產和臨床治療中應用越來越廣泛。比如第三代自滅活慢病毒載體用于造血干細胞的基因修飾，治療原發性免疫缺陷和血紅蛋白病。慢病毒載體作為CAR轉導T細胞的載體，是CAR-T細胞生產過程中的關鍵原料，對實現大規模生產、縮短生產周期具有重要意義。

01慢病毒載體和CAR-T

慢病毒載體是一種源于人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因載體。在構建慢病毒載體時，為了避免產生有復制能力的病毒，會把HIV-1基因組分裝與不同的質粒中，再共轉染細胞，獲得只有一次感染能力而無復制能力的慢病毒載體。目前慢病毒載體已從兩質粒系統發展到四質粒系統，安全性不斷提高。目前常用的是四質粒系統，有更廣泛的應用，比如基因編輯、基因治療、轉基因動物、藥物研究、CAR-T細胞治療等。

慢病毒載體有更廣泛的宿主，能夠感染分裂和非分裂細胞。對于難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能極大的提高目的基因的轉導效率。慢病毒可以將外源基因有效的整合到細胞染色體中，在靶細胞中獲得持續高效穩定的表達。慢病毒載體還可以攜帶5kb以上的目的基因，將cDNA克隆到慢病毒載體中。

慢病毒載體的生產和用途示意圖（源自參考文獻）

CAR-T細胞治療在多種癌癥的臨床上取得成功，是目前醫學研究前沿熱門的方向之一。CAR-T生產制備流程主要包括T細胞富集、分化、擴增，通過病毒或非病毒載體進行CAR基因轉移，然后再進行體外CAR-T細胞擴增，最終制成細胞產品。因此將特定的CAR基因轉導進入T細胞的病毒載體是整個生產過程的關鍵原料。目前大部分CAR-T細胞的制備使用慢病毒載體，如諾華的Kymriah和Juno的Breyanzi，依靠慢病毒載體完成CAR-T細胞制造。

CAR-T細胞治療示意圖（源自參考文獻）

02慢病毒載體生產制備

慢病毒載體作為CAR-T的核心環節，其質量對細胞產品及其治療效果具有直接影響。雖然生產慢病毒載體的步驟并不復雜，但如何大規模生產符合cGMP要求的高質量慢病毒載體仍具有挑戰性。

慢病毒的生產是一個持續幾天的細胞培養過程，將病毒載體轉移到培養基中。主要有貼壁和懸浮兩種培養方式。小規模研究可以選擇貼壁培養，但大規模生產需要懸浮培養。

慢病毒的大規模生產常用HEK293T細胞系，可以在沒有貼壁的情況下迅速懸浮生長。將包裝細胞在培養基中傳代數次，達到一定數量后，用病毒包裝質粒和目的基因載體質粒共轉染細胞。在幾天的培養過程中，包裝細胞會產生大量慢病毒顆粒，可以從培養基中收獲。病毒載體純化可使用多種方法，例如梯度純化法或色譜法。

除了細胞系，慢病毒的懸浮無血清培養已逐步替代傳統的貼壁培養模式。懸浮培養能夠降低成本和污染風險，培養及純化步驟更簡單，更容易放大。在成本方面，培養基是不可忽略的因素，選擇來源和化學成分明確、不含血清的培養基，會極大的降低成本和簡化下游純化工藝，并降低污染風險。義翹神州已成功開發多款適用于HEK293細胞懸浮培養的無血清培養基，屬于無血清、無抗生素、無動物源性組分的即用型培養基，可用于慢病毒載體大規模懸浮培養。

大規模生產還需要考慮雜質去除，比如宿主DNA，在200L的反應器中需要750mg的質粒DNA，意味著轉染過程中會有大量的殘留，因此需要選擇合適的核酸酶進行去除。

總的來說，理化性質不穩定，回收率低，培養體系和純化工藝等未攻克的問題，依舊是慢病毒規模化生產的瓶頸和關鍵。

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參考文獻：

1. Xiaoyu Wang, et al. Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy.

2. Natalia Elizalde and Juan Carlos Ramírez. Lentiviral vectors: key challenges and new developments.

3. Michael C. Milone and  Una O’Doherty. Clinical use of lentiviral vectors.

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