Mechanical force induces macrophage-derived exosomal UCHL3 promoting bone marrow mesenchymal stem cell osteogenesis by targeting SMAD1

Keywords: Exosomes; Macrophages; Mechanical force; Orthodontic tooth movement; Osteogenesis; SMAD1; UCHL3.

正畸牙齒移動（OTM）是由機械力誘導的牙槽骨重塑過程，并受局部無菌炎癥的調節，其潛在機制對解剖至關重要。巨噬細胞作為機械敏感細胞，通過分泌細胞因子和調節局部炎癥在 OTM 中起著至關重要的作用。研究證明，骨髓來源的間充質干細胞（BMSCs）具有顯著的自我更新能力和多向分化潛能，是成骨細胞的前體細胞，可以直接響應機械力并促進 OTM 期間牙槽骨的形成。因此，在機械力下巨噬細胞與BMSCs的相互串擾以促進其成骨的過程可能是 OTM 期間機械力誘導牙槽骨形成的重要組成部分。

越來越多的證據表明，外泌體在骨重塑微環境中介導了巨噬細胞和 BMSCs 之間的通訊。外泌體的雙層膜結構能很好的保護其包被的物質，如核酸、蛋白質和脂質等。此外，外泌體可以直接被 BMSCs 內吞，而不是被某些反饋機制（如細胞因子）抑制。然而，在機械力作用下，來自巨噬細胞的外泌體是否以及如何調節 BMSCs 成骨以及牙槽骨形成仍然未知。

基于此，南京醫科大學附屬口腔醫院口腔正畸科及江蘇省心血管病轉化醫學協同創新中心的研究團隊進行了深入探索，表明了機械力調節骨髓來源的巨噬細胞（BMDM）分泌的外泌體泛素羧基末端水解酶同工酶L3（UCHL3），它通過靶向Smad同源物1（SMAD1）促進 BMSCs 成骨，從而促進 OTM 期間牙槽骨形成。研究成果發布于 Journal of Nanobiotechnology 期刊題為“Mechanical force induces macrophage-derived exosomal UCHL3 promoting bone marrow mesenchymal stem cell osteogenesis by targeting SMAD1”。

首先，為了模擬體外 OTM 期間的 BMSCs 成骨，構建機械力反應培養系統，其中 BMDMs 用暴露于不同的機械刺激（MS），然后收集其上清液來處理 BMSCs（圖1 a）。通過 CCK-8 分析測定 BMDMs 在不同應變水平（0.5Hz，0、5、10、15%）或持續時間（0、2、6 、10 h）影響下的活力，發現無論時間如何變化，10% 應變水平下其細胞活力顯著增加，因此將其作為進一步實驗的標準應變幅度。

qRT-PCR、WB及ALP 染色顯示，與其他組相比，MS（10%，6 h）-BMDMs衍生的條件培養基顯著增加了 BMSCs 中成骨基因（Alp、Runx2 Col1 和 Ocn）（圖1 b-e）、成骨轉錄因子RUNX2 （圖1 f、g）、ALP 水平的表達（圖1 h），且細胞外基質礦化沉積增強（圖1 i）。這些結果證實了適度的機械力促進了 BMDM-介導的 BMSC 成骨。

隨后，探索可能在 MS-BMDMs 上清液中介導 BMSCs 成骨的參與者，并將重點放在外泌體上。TEM顯示，這些純化的囊泡具有杯狀或球形形態（圖1 J），直徑主要在 30-200 nm 之間（圖1 k）。WB 進一步證實，這些顆粒上存在 CD63 和 TSG101 等外泌體表面標志物（圖1 l）。此外，MS-BMDMs 的上清液具有比 BMDMs 更多的外泌體（圖1 m）。這些數據表明，這些納米顆粒是外泌體，機械力促進了 BMDMs 衍生的外泌體的分泌。基于這些發現，可以推測外泌體可能是 MS-BMDMs 分泌的影響 BMSCs 成骨的關鍵介質。

為了證實源自 MS-BMDMs 的外泌體在介導 BMSCs 成骨中的潛在作用，用熒光染料 Dil 標記 MS-BENDM-EXOs，并用這些外泌體處理 BMSCs 12 h，發現MS-BMDM-EXOs 顯著促進了成骨基因的 mRNA 表達和 RUNX2 蛋白水平、ALP 水平和細胞外基質礦化沉積。這表明，來自 MS-BMDMs 的外泌體促進 BMSCs 中的成骨。

圖1    機械力促進 BMDM 介導的 BMSCs 成骨。

接下來，為了探索 MS-BMDMs 衍生的外泌體在 OTM 期間牙槽骨形成中的作用，建立了小鼠 OTM 模型，并注射 GW4869（外泌體分泌抑制劑）。壓縮力（10 g）作用 14 天后，GW4869 顯著抑制了牙齒移動，牙槽骨骨體積分數（BV/TV）顯著降低，張力側的 ALP 陽性表面受到抑制，從而表明抑制外泌體會損害 OTM 期間牙槽骨的形成。局部注射PBS、BMDM-EXOs 和 MS-BMDM-EXOs 到負荷牙齒中，14 天后，發現BMDM-EXOs 處理大大提高了負荷牙齒牙槽骨的 BV/TV，并且 MS-BMDM-EXOs 進一步增強了這種效果。ALP 染色結果呈現相同的效應。這些結果表明，來自 MS-BMDMs 的外泌體促進了牙齒移動過程中牙槽骨的形成。

進一步地，通過蛋白質組學分析 MS-BMDM-EXOs 和 BMDM-EXOs 中的蛋白表達譜。在 MS-BMDM-EXOs 組的上調蛋白中，發現了UCHL3的富集，其參與細胞蛋白質修飾過程。WB結果進一步揭示，BMDMs 中的 UCHL3 蛋白水平高于 BMSCs，機械力增加了 BMDMs 和 BMDM-EXOs 中 UCHL3 的蛋白水平。因此，UCHL3 可能是 MS-BMDM-EXOs 中最重要的因子之一。

使用 TCID（UCHL3 抑制劑）處理 BMSCs，發現其顯著降低了成骨基因、RUNX2 蛋白（圖2 a-c）及ALP 表達水平和細胞外基質的礦化沉積（圖2 d、e）。這表明，UCHL3 對 BMSCs 的成骨至關重要。然后，使用 siUchl3 敲低 MS-BMDMs 中 Uchl3 的表達（圖2 f、g），MS-BMDM_siUchl3-EXOs 中 UCHL3 蛋白水平得到有效抑制（圖2 h），然后用 MS-BMDM_siCon-EXOs 和 MS-BMDM_siUchl3-EXOs 處理 BMSCs。結果顯示，與對照組相比，MS-BMDM-EXOs 中 UCHL3 下調后，BMSCs 中成骨基因、RUNX2 蛋白水平顯著下調（2 i-k），ALP 水平和細胞外基質礦化沉積也受損（圖2 l、m）。這些結果表明，UCHL3 是 MS-BMDM-EXO 介導的 BMSC 成骨所必需的。

為了確定UCHL3 在 OTM 期間介導牙槽骨形成中的作用，建立OTM 模型，并在負荷期間注射UCHL3 抑制劑 TCID 。壓縮負荷14 天，TCID 注射后牙齒移動距離明顯減小，牙槽骨BV/TV顯著降低，張力側的 ALP 陽性表面受到抑制。此外，siUchl3 敲低 MS-BMDM-EXOs 中的 UCHL3 表達后，負荷牙槽骨的 BV/TV 同樣降低，ALP 陽性表面也顯著受損。這些結果表明，OTM 期間 MS-BMDM-EXO 介導的牙槽骨形成需要 UCHL3。

圖2   UCHL3 是 MS-BMDM-EXO 介導的體外 BMSC 成骨所必需的。

最后，實驗探討了 MS-BMDM 衍生的外泌體 UCHL3 調節 BMSCs 成骨的機制。據報道，UCHL3 可以與 SMAD1 相互作用，SMAD1 是一種參與 BMSC 成骨的經典相關分子。因此，研究人員假設UCHL3 可以通過調節 SMAD1 介導 BMSC 成骨。為了驗證 UCHL3 和 SMAD1 之間的相關性，使用 TCID 和 MS-BMDM_siUchl3-EXOs 處理 BMSCs，發現當 UCHL3 被敲低時，SMAD1 的蛋白水平下調（圖3 a-c）。然后，在BMSCs中過表達 SMAD1，發現其顯著逆轉了 MS-BMDM-EXOs 中 UCHL3 抑制引起的成骨基因表達、RUNX2 蛋白（圖3 d-f）、ALP 水平和細胞外基質礦化沉積的下調（圖3 g、h）。

那么，UCHL3 如何調節 BMSCs 中 SMAD1 的功能？Alphafold 2 的蛋白質對接結果顯示，UCHL3 可以通過氫鍵直接與 SMAD1 結合（圖3 i）。進一步的免疫熒光和免疫共沉淀驗證了 BMSCs 中 UCHL3 和 SMAD1 之間的相互作用（圖3 j-l）。此外，TCID 對內源性UCHL3 的抑制提高了 BMSCs 中內源性 SMAD1 的泛素化水平（圖3 m），這表明 UCHL3 可以通過去泛素化提高 SMAD1 蛋白的穩定性。同時，免疫組化染色實驗顯示，UCHL3 抑制劑 TCID 降低了牙齒移動小鼠負荷牙槽骨中的 SMAD1 水平。這些結果表明，SMAD1 是 MS-BMDM-EXO 衍生的 UCHL3 促進 BMSCs 成骨所必需的。

圖3    MS-BMDM 衍生的外泌體 UCHL3 通過靶向 SMAD1 促進 BMSCs 成骨。

圖4    圖形概要

研究表明，機械力誘導的巨噬細胞衍生的外泌體 UCHL3 通過靶向 SMAD1 促進 BMSCs 成骨，從而促進 OTM 期間牙槽骨的形成。

總之，該研究表明，機械力可以改變巨噬細胞衍生的外泌體中的蛋白質組成。外泌體將 UCHL3 從機械刺激的巨噬細胞轉移到 BMSCs，提高了 BMSCs 中的 SMAD1 水平，這有利于 BMSCs 成骨，從而促進 OTM 期間牙槽骨的形成。因此，這些發現從巨噬細胞衍生的外泌體調節 BMSCs 成骨的角度證明了 OTM 過程中機械力誘導成骨的機制，這可能有助于開發正畸治療臨床問題的新解決方案。

參考文獻：Pu P, Wu S, Zhang K, Xu H, Guan J, Jin Z, Sun W, Zhang H, Yan B. Mechanical force induces macrophage-derived exosomal UCHL3 promoting bone marrow mesenchymal stem cell osteogenesis by targeting SMAD1. J Nanobiotechnology. 2023 Mar 14;21(1):88. doi: 10.1186/s12951-023-01836-z. PMID: 36915132; PMCID: PMC10012474.

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