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Co-IP 實驗不踩坑：蛋白 “拉下場“ 的秘密！揭秘Co-IP實驗操作技巧
圖 1. Co-IP 原理圖。
X：誘餌蛋白，Z：靶標蛋白
簡單來說，就是利用抗體捕捉目標蛋白，看看有哪些其他蛋白會“搭順風車”來到沉淀派對。這樣我們就可以知道哪些蛋白質在細胞內是好朋友，經常一起 Hang out！
可沉淀誘餌蛋白在天然組織細胞狀態下存在互作關系的所有蛋白；
可沉淀整個復合體中直接/間接互作的多個蛋白，研究復合體組成；
可與質譜鑒定連用可以初篩到一系列未知蛋白，再通過其他技術進一步驗證；
分離得到天然狀態下相互作用的蛋白質復合體，結果更真實可靠。
Co-IP 分類
在眾多 Co-IP 分類方式中，內源性和外源性 Co-IP 就像科研界的雙子星，不僅最-常用，還各自閃耀獨-特的光芒！
小貼士：
內源性 Co-IP：研究細胞或組織中自然表達的蛋白質。
外源性 Co-IP：研究經過轉染介導的外源表達系統來表達的蛋白質。
Co-IP 實驗流程
圖 2. Co-IP 實驗流程圖[1][5]。
采用適當的方法收集細胞，使用含有合適的蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細胞。
將含有保護液的蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 瓊脂糖混勻取出，用平衡液清洗磁珠/瓊脂糖凝膠。
將細胞裂解液或已預處理的樣本用蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 瓊脂糖進行預清洗，去除非特異性結合的蛋白質。
預清洗的樣本中加入誘餌蛋白的特異性抗體，孵育促進抗體與蛋白結合。加入蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 瓊脂糖繼續孵育使其與復合物結合。
洗滌復合物，去除非特異性結合蛋白。
加入洗脫緩沖液，洗脫。
Western Blot 或質譜檢測分析沉淀的誘餌蛋白及與其結合的靶標蛋白。
Co-IP 結果解讀
隨著 Co-IP 實驗流程的完成，我們終于手握初步數據！那么，這些數據能告訴我們什么秘密？結果出來了，腫么分析呢？
以下讓小 M 通過兩個經典案例，來看看如何解讀實驗結果，挖掘蛋白質相互作用的“朋友圈”！
圖 3. 內源性 ANT2 和 GRP75之間存在相互作用[6]。
圖 4. 外源 GRP75 可增強 ANT2-UCP1 的相互作用[6]。
避坑指南：如何高效無誤地進行 Co-IP?
樣品準備：打好地基
關注點 | 說明 |
裂解液 | 溫和的非離子型洗滌劑 (如 NP-40、Triton X-100) 可以保護蛋白的天然結構，同時避免過強的去污劑 (如 SDS) 破壞蛋白相互作用。 MCE 裂解液推薦：WB/IP 裂解液、NP-40 裂解液、哺乳動物活性蛋白抽提試劑。 |
鹽濃度 | 樣品準備時體系中的鹽濃度范圍在 150 - 300 mM 即可，過高可能“拆散”蛋白關系，過低可能導致背景蛋白“攪局”。 |
蛋白酶抑制劑 | 適當加入蛋白酶抑制劑，保護“核心成員”防止其被細胞內源性蛋白酶降解。 MCE 蛋白酶抑制劑推薦：蛋白酶抑制劑 Cocktail、蛋白酶抑制劑 Cocktail, 片劑。 |
結構干擾 | 提前查閱文獻了解蛋白“愛好”，重視蛋白修飾，如磷酸化、乙酰化等是否會影響復合物的穩定性。 |
表達水平 | 提前驗證目標蛋白表達水平，表達低可考慮優化轉染或表達條件。 |
溫度 | 低溫環境下制備樣品，防止蛋白“跑路”。 |
抗體選擇：定向輸出
無論是拉下目標蛋白還是背景干擾，抗體都能“一錘定音”。
關注點 | 說明 |
抗體專一性 | 選擇經過 IP 驗證的抗體，不可盲選。 MCE 標簽抗體：DYKDDDDK Tag (FLAG) 抗體、HA tag 抗體 (YA856)、Myc-tag 抗體。 |
同型對照 | 根據 IP 抗體類型選擇合適的同型對照抗體。 MCE 同型對照抗體推薦：Rabbit IgG Isotype Control、Mouse IgG Isotype Control。 |
抗體來源 | 一抗和二抗的宿主種屬要避開“同宗”，否則背景會搶戲。 |
抗體測試 | 必要時進行預實驗封閉抗體測試，驗證磁珠/瓊脂糖珠可與抗體有效結合。 |
抗體用量 | 太多可能造成非特異性沉淀，太少又可能拉不住目標蛋白。建議從優化實驗中找到合適的濃度和用量。 |
二抗選擇 | 如果抗體重鏈和目標蛋白大小相近，可選擇輕鏈特異性二抗避免“撞車”。 |
實驗設計：精準操作
實驗環節 | 說明 |
實驗設計 | 確定研究的蛋白質對，不胡亂邀請“不相干”的蛋白。 |
對照組設計 | 實驗組、IgG 陰性組、陽性組 (Input)。 |
洗滌條件 | 適當調整洗滌強度 (如低鹽到高鹽、去垢劑濃度等)，既要去除非特異性蛋白，又要保護靶蛋白復合物。 |
Western Blot | 用 Western Blot來做最后的“身份確認”，確保邀請到的都是真正的“貴賓”。 |
如何讓你的 Co-IP 實驗更上一層樓？
每次實驗的具體條件、操作步驟記得詳細記錄，這樣才能在出現問題時找到原因，不斷優化喔~
如果你覺得這篇干貨滿滿的 Co-IP 秘籍有幫助，別忘了點贊、分享哦！期待在評論區看到你們的精彩討論和寶貴經驗！我們下期再見，繼續解鎖更多實驗技巧，讓科研不再有坑，只有驚喜！
HA 標簽蛋白 IP，外源性 Co-IP 實驗 |
IP、內源性 Co-IP 實驗 |
Flag 標簽蛋白 IP，外源性 Co-IP 實驗 |
兔 IgG 陰性對照 |
鼠 IgG 陰性對照 |
參考文獻：
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