Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells under cyclic tensile stress

Keywords: Integrin αVβ3; Mesenchymal stem cells; Osteogenesis; Tensile stress; Yes-associated protein (YAP).

骨搬運技術(shù)是目前修復肢體骨缺損的主要方法之一。在骨修復的過程中，牽張應力刺激細胞的增殖與分化，從而實現(xiàn)骨與軟組織的同步再生。目前如何修復大骨缺損的一個重要研究方向是如何在體內(nèi)促進干細胞的成骨分化。其中，間充質(zhì)干細胞（MSCs）是具有成骨、成軟骨、成脂肪和成肌分化功能的多能細胞，在再生醫(yī)學中具有巨大的潛力。

整合素是一類重要的細胞表面受體，由α亞基和β亞基以非共價鍵結(jié)合形成的跨膜異二聚體糖蛋白。整合素通過募集多種細胞內(nèi)蛋白并將細胞內(nèi)微絲細胞骨架與細胞外基質(zhì)（ECM）連接起來形成黏著斑復合物，從而將機械信號從細胞外部傳遞到細胞內(nèi)部。YAP 是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，可與 TEAD-DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合以促進細胞增殖并調(diào)節(jié)干細胞分化。然而，循環(huán)牽張應力（CTS）影響細胞內(nèi) YAP 表達從而調(diào)節(jié) MSCs 成骨的機制仍不清楚。

鑒于整合素與機械轉(zhuǎn)導的密切相關(guān)，廣東省醫(yī)學3D打印與生物力學重點實驗室歐陽鈞教授科研團隊在一項研究中探討了人間充質(zhì)干細胞成骨過程中牽張應力和整合素αVβ3對細胞分化的影響。研究表明，整合素αVβ3 在循環(huán)牽張應力誘導的 MSCs成骨過程中表達增加，其活化可導致肌動蛋白絲結(jié)構(gòu)的重排，從而調(diào)控 YAP 核定位，且機械信號通過 αVβ3-微絲軸影響 MSCs 的成骨。這表明，αVβ3 可能在干細胞水平上作為骨修復的新靶點。研究成果發(fā)表在 Cell Communication and Signaling 期刊題為“Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells under cyclic tensile stress”。

首先，研究調(diào)查了 MSCs 中循環(huán)牽張應力（10%形變，0.5 Hz頻率，2 h/d，7d）與早期成骨分化之間的關(guān)系，與對照組相比，CTS負荷 7 天后 MSCs 中成骨標志物 ALP 和 RUNX2 的蛋白質(zhì)和 mRNA 表達增加，這表明，循環(huán)牽張應力可促進 MSCs 的早期成骨分化。

然后，通過qRT-PCR 分析整合素αVβ3 的表達水平以驗證整合素是否參與循環(huán)牽張應力誘導的 MSCs 成骨分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在循環(huán)牽張應力下整合素αVβ3 的表達高于對照組，表明循環(huán)牽張應力促進了整合素αVβ3 的表達。

因此，繼續(xù)研究整合素αVβ3 與循環(huán)牽張應力誘導的 MSCs 早期成骨分化之間的關(guān)系。通過整合素αVβ3 的拮抗劑 RGDyk抑制整合素αVβ3 在 MSCs 中的功能，發(fā)現(xiàn)與 CTS 組相比，RGDyk 組的 ALP 染色較淺（圖1 a）。Western blotting 顯示，當 MSC 整合素αVβ3 受到抑制時，RGDyk 組的成骨標志物 ALP 和 RUNX2 的表達相對于 CTS 組降低（圖1 b）。此外，當整合素αVβ3 功能受到抑制時，ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表達也降低（圖1 c）。以上結(jié)果表明，循環(huán)牽張應力可以通過整合素αVβ3 的表達和活化影響 MSCs 的早期成骨分化。

圖1    CTS 通過整合素αVβ3 調(diào)節(jié) MSCs 成骨分化的早期階段。（a） CTS 下GM、CTS 和 RGDyk 組的 ALP 染色。（b）CTS 下GM 和 RGDyk 組 ALP 和 RUNX2 的蛋白表達。（c）CTS 下GM 和 RGDyk 組 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表達。實驗分組：在生長培養(yǎng)基中未分化的 MSCs（GM 組）、循環(huán)牽張應力施加 7 天的 MSCs（CTS 組）、在循環(huán)牽張應力下用 RGDyk 處理的 MSCs（RGDyk 組）、在循環(huán)牽張應力下用細胞松弛素D 處理的 MSCs（CytoD 組）和在循環(huán)牽張應力下用維替泊芬處理的 MSCs（VP 組）。

黏著斑復合物連接整合素αVβ3 和肌動蛋白絲，并以此來傳導機械信號。因此，接下來探討了黏著斑相關(guān)蛋白踝蛋白（Talin-1）、黏著斑激酶（FAK）和紐蛋白（Vinculin）在循環(huán)牽張應力下的表達，并檢測了talin-1、FAK 和vinculin 在整合素αVβ3 激活下的表達。Western blotting 和 qRT-PCR 結(jié)果表明，與對照組相比，循環(huán)牽張應力有效提高了 MSCs 中三者的表達水平。使用RGDyk抑制整合素αVβ3功能后，RGDyk組其表達水平相對于CTS組降低。

免疫熒光顯示，未經(jīng)牽張應力加載時細胞膜周邊可見零星點狀黏著斑復合體，而在循環(huán)牽張應力負荷后，黏著斑復合體顯著增多。當整合素 αVβ3 功能受到抑制時，黏著斑復合體又顯著減少。這表明，循環(huán)牽張應力通過激活整合素 αVβ3 增加 MSCs 中黏著斑的形成。

通過western blotting和qRT-PCR實驗，發(fā)現(xiàn)在循環(huán)牽張應力的作用下，β-肌動蛋白（β-actin）的表達升高（圖2 a）。為了了解機械轉(zhuǎn)導過程中整合素αVβ3 和肌動蛋白絲之間的關(guān)系，進一步檢測了抑制整合素αVβ3 后 β-actin 表達的變化。結(jié)果顯示，與 CTS 組相比，MSCs 中 RGDyk 組的 β-actin表達水平降低（圖2 a）。免疫熒光實驗顯示，GM 組肌動蛋白絲排列平直緊密，呈細長絲狀，但在循環(huán)牽張應力下形成較粗壯的應力纖維絲，排列方向不規(guī)則且微絲結(jié)構(gòu)向細胞膜方向聚攏。當整合素αVβ3 受到抑制時，肌動蛋白應力纖維絲略微增厚，并類似于 GM 組呈平直緊密方式排列（圖2 c）。以上結(jié)果表明，循環(huán)牽張應力通過整合素αVβ3 調(diào)節(jié) β-actin的表達并影響肌動蛋白絲的結(jié)構(gòu)。

此外，為了研究肌動蛋白絲與循環(huán)牽張應力誘導的 MSCs 成骨分化之間的關(guān)系，使用細胞松弛素D（cytochalasin D）來抑制肌動蛋白絲的聚合。結(jié)果顯示，細胞松弛素D 在牽張應力下降低 ALP 和 RUNX2 的表達（圖2 d），這表明，循環(huán)牽張應力可以通過整合素αVβ3-肌動蛋白絲軸促進 MSCs 的早期成骨分化。

圖2   肌動蛋白絲通過 MSC 中的整合素αVβ 的激活調(diào)節(jié) CTS 誘導的早期階段成骨分化。（a）第4 天和 7 天CTS 下 β-肌動蛋白的蛋白質(zhì)和 mRNA 表達。（b）CTS 和 RGDyk 組 CTS 下 β-肌動蛋白的蛋白和 mRNA 表達。（c）GM組、CTS組和RGDyk組在CTS作用下F-肌動蛋白的免疫熒光觀察7天。

最后，研究探討了循環(huán)牽張應力對細胞核 YAP 的影響機制。Western blotting 顯示，循環(huán)牽張應力增加了核 YAP 的表達（圖3 a）。整合素αVβ3 受到抑制后，RGDyk 組核 YAP 的表達低于 CTS 組（圖3 b）。根據(jù)免疫熒光結(jié)果，GM 組染色的核內(nèi)YAP蛋白呈模糊細胞核狀輪廓。在循環(huán)牽張應力下，細胞核 YAP 蛋白呈高亮表達，輪廓清晰。在整合素αVβ3 被抑制后，RGDyk 組的核內(nèi) YAP 染色低于 CTS 組（圖3 c）。以上結(jié)果表明，循環(huán)牽張應力通過整合素αVβ3 影響 YAP 核定位。

當細胞松弛素D 抑制 β-actin聚合時，細胞核 YAP 的表達在循環(huán)牽張應力下降低（圖3 d）。此外，使用維替泊芬（Verteporfin）抑制核內(nèi)YAP蛋白功能，western blotting顯示YAP 核定位在牽張應力下降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，促進肌動蛋白絲結(jié)構(gòu)上的循環(huán)牽張應力可以增加 YAP 核定位，從而影響 MSCs 的早期成骨分化。

圖3     整合素αVβ3 和肌動蛋白絲在 CTS 誘導的早期成骨分化中調(diào)節(jié)核 YAP 的表達。（a）CTS 下核 YAP 蛋白表達。（b）CTS 和 RGDyk 組 CTS 下核 YAP 的蛋白表達。（c）GM、CTS 和 RGDyk 組 CTS 下 YAP 免疫熒光。（d）GM 和 CytoD 組 CTS 下核 YAP 的蛋白表達。（e）GM 和 VP 組 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的蛋白表達

總之，該研究表明，循環(huán)牽張應力通過激活整合素αVβ3 對 MSCs早期成骨分化產(chǎn)生積極影響，導致肌動蛋白絲的重排和黏著斑復合物的形成增加。此外，在循環(huán)牽張應力刺激下，肌動蛋白絲的重排通過整合素αVβ3 在人MSCs 中增加了YAP 核定位。因此，整合素αVβ3 和 YAP 核定位可參與 MSCs 的早期成骨分化。實驗結(jié)果有助于對循環(huán)牽張應力誘導的人 MSCs 的早期成骨分化產(chǎn)生新的理解。

參考文獻：Peng Y, Qu R, Yang Y, Fan T, Sun B, Khan AU, Wu S, Liu W, Zhu J, Chen J, Li X, Dai J, Ouyang J. Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells under cyclic tensile stress. Cell Commun Signal. 2023 Oct 30;21(1):308. doi: 10.1186/s12964-022-01027-7. PMID: 37904190; PMCID: PMC10614380.

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