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宿主細(xì)胞蛋白 (Host cell protein, HCP) 是宿主細(xì)胞 (CHO, HEK293, E.coli, Sf9等) 生產(chǎn)或編碼產(chǎn)生的非目標(biāo)蛋白，是生物藥物中過程相關(guān)雜質(zhì)的主要組成部分，雖然絕大多數(shù)宿主細(xì)胞蛋白（大于99%）均在下游工藝中被去除，但仍可能有少量HCP殘留與藥物產(chǎn)品共純化，其中有些殘留蛋白被認(rèn)為是高風(fēng)險(xiǎn)HCPs, 可能具有免疫原性、生物活性或酶活性，或有可能降解產(chǎn)品分子或輔料，對藥物質(zhì)量和安全性產(chǎn)生重要影響，因此這類高風(fēng)險(xiǎn)HCPs是制藥企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)關(guān)注的重點(diǎn)。
中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO表達(dá)系統(tǒng)一直是單抗等生物技術(shù)藥物生產(chǎn)中常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)之一，因?yàn)樗軌蛏a(chǎn)類似于人類產(chǎn)生的翻譯后修飾的復(fù)雜蛋白質(zhì)。對CHO細(xì)胞培養(yǎng)液的下游純化通常包括蛋白A親和層析，然后是精純步驟以進(jìn)一步去除聚集物、電荷變體、HCP和宿主細(xì)胞DNA。在純化過程中絕大多數(shù)HCP被清除，但可能有一些HCP由于以下兩種方式“逃脫”清除：
1
HCP具與產(chǎn)品特異性或非特異性結(jié)合的能力并在工藝過程中被攜帶；
2
HCP有與蛋白A色譜填料相互作用的能力，導(dǎo)致其與產(chǎn)品共同洗脫。
HCP危害與分類
HCP的潛在風(fēng)險(xiǎn)受多種因素影響，包括藥物適應(yīng)癥、給藥途徑、給藥頻率、每個(gè)給藥劑量的HCP數(shù)量、病人群體、HCP與人類對應(yīng)物的同源性，以及先前的非臨床和/或臨床經(jīng)驗(yàn)。
HCP對產(chǎn)品質(zhì)量、安全性和有效性的潛在影響：
免疫原性：抗藥抗體，誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生等
效價(jià)：蛋白聚集或降解
穩(wěn)定性：脂肪酶降解輔料
安全性：與內(nèi)源蛋白相互作用，類免疫佐劑作用
BPDG HCP工作小組基于單個(gè)HCP與產(chǎn)品共純化的能力、在下游工藝中出現(xiàn)的頻率、其改變或降解藥物/輔料的能力，以及潛在的免疫原性將高風(fēng)險(xiǎn)HCP的影響分為四大類：
1）產(chǎn)品質(zhì)量，2）制劑，3）對人體的直接生物學(xué)功能，以及4）免疫原性。
目前有多種方法可以識別和定量藥物開發(fā)過程中存在的全部和個(gè)別特定HCP的水平。每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。可按照以下綜合分析策略，正確測量已知的HCP雜質(zhì)，如果確定為高風(fēng)險(xiǎn)的HCP，則制定控制策略以監(jiān)測和/或消除這些雜質(zhì)。
01 通過免疫測定法（如ELISA）測量總HCP，是確定殘留HCP水平以指導(dǎo)工藝開發(fā)以及支持GMP批次放行檢測的主要工作手段。開發(fā)總HCP免疫測定法所需的關(guān)鍵試劑應(yīng)經(jīng)過詳細(xì)的表征。
02 應(yīng)使用額外的正交方法，如2D凝膠電泳/Western，和/或抗體親和提取（Antibody Affinity Extraction，AAE）后進(jìn)行質(zhì)譜分析，評估關(guān)鍵抗體試劑對工藝特定HCP的覆蓋率。
03 總HCP 免疫測定應(yīng)常規(guī)進(jìn)行，以確定工藝樣品中HCP的水平。
04 建議采用正交方法，如質(zhì)譜和/或額外的單個(gè)HCP檢測方法，以確保產(chǎn)品純度，特別是當(dāng)免疫測定檢測到總HCP水平升高、觀察到稀釋非線性或觀察到產(chǎn)品質(zhì)量影響時(shí)。
05 如果個(gè)別HCP被確認(rèn)并被認(rèn)為是潛在的高風(fēng)險(xiǎn)：
a
可能需要開發(fā)一種特定的免疫測定法以監(jiān)測已知的雜質(zhì)，或開發(fā)一種有針對性的質(zhì)譜分析方法，以更好地了解HCP的水平及其潛在影響。
b
如果確定的雜質(zhì)具有酶活性，可以開發(fā)一種活性測定法以指導(dǎo)工藝和產(chǎn)品開發(fā)，監(jiān)測、去除和/或滅活該蛋白質(zhì)。
c
通過in silico方法進(jìn)行免疫原性評估，如果預(yù)測表明免疫原性風(fēng)險(xiǎn)很高，可以進(jìn)行體外比較免疫原性評估（IVCIA）。
d
毒理學(xué)研究評估臨床風(fēng)險(xiǎn)。
用于總HCP定性和定量分析的方法主要是免疫測定法，通常使用一種或多種ELISA方法進(jìn)行檢測。但是傳統(tǒng)ELISA具有以下局限：
?
•
多個(gè)孵育和洗滌步驟，需要大量的動(dòng)手操作和分析時(shí)間，樣品檢測通量非常有限；
?
•
動(dòng)態(tài)范圍很窄（±100 ng/mL），在下游工藝研究期間需要進(jìn)行大量的重復(fù)檢測；
?
•
樣品和試劑消耗量大，這對特定低水平HCP的檢測來說是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)橐獜乃幬镂镔|(zhì)中產(chǎn)生足夠的HCP是非常困難的。這使得ELISA在滿足下游工藝開發(fā)團(tuán)隊(duì)日益增長的速度、通量和樣品量消耗等方面出現(xiàn)瓶頸。
所以，目前已經(jīng)有越來越多的制藥企業(yè)轉(zhuǎn)向了有助于提高通量和加快周轉(zhuǎn)速度的高通量免疫分析平臺如Gyros公司的Gyrolab®全自動(dòng)免疫分析平臺，Gyrolab技術(shù)利用鏈霉親和素包被的微珠捕獲生物素化的捕獲試劑，樣品與捕獲試劑結(jié)合后用熒光標(biāo)記的檢測試劑檢測結(jié)合的樣品。這種在親和柱上以流穿模式（Flow-through）進(jìn)行的免疫測定非常快速并且不需要孵育時(shí)間，與傳統(tǒng)ELISA相比大大減少了完成分析所需的時(shí)間以及樣品和試劑量的消耗。全自動(dòng)化控制運(yùn)行使Gyrolab檢測具有優(yōu)良的可重復(fù)性。因此，Gyrolab自動(dòng)化的高通量分析方法能夠?yàn)楣に囬_發(fā)和QC放行檢測中的HCP分析提供有效的支持：
?
快速的分析周轉(zhuǎn)效率；
?
出色的檢測通量；
?
數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，結(jié)果可重復(fù)性高。
總體上，這種方法可提高生物分析部門的效率，大大減少手工操作時(shí)間，除去因稀釋錯(cuò)誤或人為操作誤差導(dǎo)致的重測要求，并大幅提高分析結(jié)果的產(chǎn)量、質(zhì)量和可重復(fù)性。
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