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α-黑素細胞刺激素(α-MSH)負責觸發褪黑激素的產生，褪黑激素是人體抵御紫外線(UV)輻射的天然保護。皮膚暴露于紫外線會促進α-MSH的產生；然而，在紫外線暴露前刺激褪黑激素的生物合成可能會預防紫外線誘導的皮膚癌。
考慮到天然形式的α-MSH在體內太不穩定而不能作為治療劑施用，人們合成了不同的類似物，其中之一是MT-II(圖1)，一種對酶降解具有高抗性和非凡效力的環狀類肽。
圖1
由于MI-II的生產往往需要放大到KG級別以滿足臨床需求，因此在實驗室規模的工藝條件優化必須考慮到工藝的可放大性。
Gyros Protein Technologies 提供從實驗室到中試級別的多肽合成儀，幫助從工藝開發階段順利放大到商業化生產。
本文案例將討論全自動合成的途徑的優化和放大，即線性序列的合成和最終肽的樹脂上內酰胺化。在這項工作中， MT-II大規模合成的優化分三個階段進行：
1找到樹脂上環化的適當保護方案；
2使用PurePep Chorus小規模優化合成條件并完成環化，儀器全自動運行；
3在中試規模合成器PurePep Sonata+上，利用先前優化的條件放大合成MT-II。
01尋找合適的樹脂上環化保護方案
MT-II的結構在天冬氨酸和賴氨酸之間形成內酰胺橋后完成，并且這些殘基需要在樹脂上環化步驟之前選擇性地去保護。因此，理想的是找到可以伴隨去除的側鏈保護基團，以最小化脫保護的難度。本實驗第一階段中，使用不同組合的側鏈保護基團合成MT-II：
1Asp(ODmab)/Lys(ivDde)
2Asp(O-2-PhiPr)/Lys(Mtt)
3Asp(OAlly)/Lys(Alloc)
可以分別用2%肼的DMF溶液、1%TFA的DCM溶液以及鈀-四(三苯基膦)(Pd(PPh3)4)和苯基硅烷(PhSiH)的DCM中溶液同時且選擇性地除去。最終肽的粗純度示于表1中。
表1 不同組合側鏈保護基團合成的MT-II粗肽純度
當比較不同的保護方案時，組合2獲得的粗肽純度最高。然而，Fmoc-Asp(O-2-PhiPr)-OH相對昂貴，會給后續的放大生產增加成本。組合1獲得的粗肽純度最低，這歸因于通過用2%肼處理對ODmab和ivDde的去保護效果不佳。此外，盡管組合3呈現出比組合2低得多的粗純度，但經過分析這主要與天冬酰胺的形成有關。通過最小化該副反應，可以顯著提高粗肽純度。因此，選定Asp(OAlly)/Lys(Alloc)作為合成MT-II單體并進行下一步優化。
02 小規模優化縮合條件
我們首先研究了DIC和OxymaPure用于偶聯步驟，沒有預活化(4)和預活化5分鐘(5)。與組合3一樣，由于天冬酰胺的形成，這些方法導致粗肽純度顯著降低(表2)。因此，MT-II以逐步方式合成：將肽合成至His(His-D-Phe-Arg-Trp-Lys(Alloc)-樹脂)，并用HCTU/NMM(6)或DIC/OxymaPure(7)進行Asp(OAlly)的縮合。在Asp(OAlly)縮合后，進行微切割，其中沒有觀察到天冬酰亞胺的形成。這些片段的粗純度為88.9%。
表2 不同條件下合成MT-II 的純度
線形肽的合成
線性MT-II在PurePep Chorus上以100 μmol規模在Rink Amide MBHA樹脂(0.35 mmol/g)上合成。在合成之前，將樹脂在DMF中溶脹2 ×10分鐘。脫保護步驟用20%哌啶DMF溶液進行2 × 5分鐘，縮合步驟用5當量AA，5當量DIC和5當量OxymaPure DMF溶液中的(無預活化-4，或5分鐘預活化-5)，在室溫下持續30分鐘。對于片段7和9，Asp(OAlly)和Nle在與5相同的條件下縮合。對于片段6和8，在室溫下，將Asp(OAlly)和Nle與HCTU(5當量)和NMM(10當量)在DMF中縮合，預活化時間為5分鐘，單次縮合時間為30分鐘。MT-II的末端胺在室溫下用10% Ac2O的DMF溶液乙酰化30分鐘。
Asp和Lys側鏈保護基團的選擇性去除：Asp(OAlly)和Lys(Alloc)的脫保護用0.2當量Pd(PPh3)4在24當量PhSiH的DCM溶液在室溫下洗滌兩次60分鐘，然后用DCM和DMC各洗滌3次。
樹脂上環化
在室溫下，用吡肟(5當量)和DIPEA(5當量)在DMF溶液中進行樹脂上環化60分鐘。
切割
樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌6次，然后干燥20分鐘。每次切割用TFA/EDT/H2O/TIS(94：2.5：2.5：1)的混合物在室溫下進行60分鐘，然后在乙醚中沉淀。
03在PurePep Sonata+ 上放大MT-II 的合成
在PurePep Chorus上小規模優化合成后，得出方案8為最優方案。在PurePep Sonata+上大規模(5 mmol)合成MT-II。
根據方案8的合成方法和條件，MT-II在PurePep Sonata+ 上合成直至Asp(OAlly)【Fmoc-Asp(OAlly)-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys(Alloc)-樹脂】，之后選擇性除去側鏈保護基團，用于隨后的樹脂上環化。環化后，通過加入Nle和N-末端乙酰化完成序列。按照該策略，獲得了粗純度為80.2%的MT-II，這與在 PurePep Chorus上合成0.1 mmol規模的粗肽純度相當。
結論
● 在PurePep Chorus 多通道多功能全自動合成儀，可以實現小規模MT-II的合成并對不同合成條件進行探索和優化，隨后可順利將最優合成條件放到到PurePep Sonata+上進行，合成規模從100µmol放大到5mmol(增加50倍), 得到的粗肽純度幾乎一致為80.1%。
● 該研究得益于PurePep Chorus的靈活性，MT-II是從頭到尾全自動合成：從線性多肽到選擇性側鏈脫保護和樹脂上環化，每一步選擇不同的縮合條件，并且可在合成過程中進行在線微切割提取樣品進行測試，以便根據實驗結果調整條件。在PurePep Chorus上的工藝的可順利轉移放大到PurePep Sonata+ 并得到相同的結果。
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