介紹

細胞凋亡（Apoptosis）通常是指機體細胞在發育進程中或者受到某些特定因素影響時，經由細胞內基因及其產物的調控而引發的一種程序性細胞死亡現象。在細胞凋亡的途徑里，各個事件的發生具有時序性，依先后順序逐一出現，最終促成凋亡小體的呈現，接著細胞便發生凋亡。細胞凋亡在胚胎發育與形態發生、維持組織內正常細胞群體的穩定、機體的防御及免疫反應、疾病或中毒引發的細胞損傷、老化以及腫瘤的發生發展等方面都起著至關重要的作用，并且具備潛在的治療價值。

圖1：細胞凋亡途徑各時序性事件

檢測原理

正常細胞膜的磷脂分布是不對稱的，活細胞中磷脂酰絲氨(phosphatidylserine, PS)位于細胞膜的內表面，細胞凋亡時，細胞膜發生變化，PS從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面。Annexin V是一種對PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結合蛋白，Annexin V可以特異性地識別凋亡細胞表面的PS，而活細胞的PS位于細胞膜的內表面，無法與Annexin V特異性結合。

壞死細胞的PS也會從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面，Annexin V也能識別壞死細胞表面的PS，所以Annexin V無法區分壞死細胞和凋亡細胞。而PI染料能夠與細胞內的DNA結合，區分壞死細胞和活細胞。早期凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整，PI染料無法自由通過細胞膜進入細胞內與DNA結合，所以PI染料無法標記凋亡細胞和活細胞，而PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜與細胞內的DNA結合，壞死細胞內PI染料被488nm激光激發后會發射紅熒光，被相應通道接收。所以Annexin V和PI同時使用，就可以區分活細胞、早期凋亡細胞和晚期凋亡或壞死細胞。

圖2 Annexin V / PI檢測原理

流式細胞術檢測

FITC最大激發波長為488 nm，最大發射波長525 nm，FITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI-DNA復合物的最大激發波長為535 nm，最大發射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖，FITC為橫坐標，PI為縱坐標。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

圖3 流式結果分析

常見問題

Q：Annexin V 細胞凋亡檢測可以應用到植物或是細菌（原核生物）嗎？

A：可以，但是需要制備原生質體，因為植物細胞或是細菌（原核生物）含有細胞壁，具體的染液使用劑量只需浸沒細胞即可，染色時間對于不同細胞有一定的不同。

Q：實驗結果如何判斷？

A：活細胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）、晚期凋亡細胞和壞死細胞呈現雙陽性（Annexin V+/PI+）、裸核（Annexin V-/PI+）。

Q：Annexin V和TUNEL有什么區別？

A：末端脫氧核苷酸轉移酶 dUTP 缺口末端標記 (TUNEL) 是一種染色方法，用于識別細胞內 DNA 片段化位點——晚期細胞凋亡的標志性特征。

Annexin V 染色通過結合由于細胞膜不對稱性喪失而暴露在細胞外的 PS 殘基來識別細胞凋亡的早期階段。

Q：是否可以僅使用Annexin V-FITC進行檢測而不檢測PI？

A：可以的。對于特殊的檢測樣本，如紅細胞無細胞核，或使用藥物Doxorubicin（阿霉素）對PI檢測存在干擾，對于這兩種情況可以僅使用Annexin V-FITC進行檢測。

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