ELISpot是一種用于定量分泌某種特定靶標(biāo)分析物細(xì)胞的免疫測(cè)定方法。整個(gè)刺激過(guò)程中細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、抗體或其他靶蛋白在分泌后會(huì)立即被特異性抗體捕獲，這種即時(shí)捕獲使ELISpot成為一種在單細(xì)胞水平上極其靈敏的檢測(cè)方法。

細(xì)胞在刺激存在或不存在的情況下，在包被有特異性捕獲抗體的膜孔中進(jìn)行培養(yǎng)，因此，細(xì)胞分泌的目標(biāo)蛋白會(huì)被立即捕獲。經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間孵育后，取出細(xì)胞，使用檢測(cè)抗體檢測(cè)分泌的靶標(biāo)分析物。加入染色底物后，最終在膜表面上出現(xiàn)可見(jiàn)的斑點(diǎn)。每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)單獨(dú)的分泌目標(biāo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞。

圖1.ELISpot檢測(cè)示意圖

想要做好ELISpot實(shí)驗(yàn)，從最開(kāi)始包被抗體到最后檢測(cè)的每個(gè)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)都需要注意。大家往往可能會(huì)忽略一個(gè)細(xì)胞處理的細(xì)節(jié)步驟，即細(xì)胞靜置步驟。該步驟有可能會(huì)顯著影響ELISpot實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。下面Mabtech帶我們深入了解一下為什么細(xì)胞靜置這一步至關(guān)重要，以及如何正確完成。

ELISpot分析非常靈敏，能夠檢測(cè)到分泌靶標(biāo)分析物的單個(gè)細(xì)胞，但實(shí)際情況中有可能非實(shí)驗(yàn)性體內(nèi)刺激或分離細(xì)胞過(guò)程中的攪動(dòng)會(huì)使細(xì)胞自發(fā)分泌高水平的靶標(biāo)分析物，如細(xì)胞因子或抗體，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果失真。ELISpot檢測(cè)前的細(xì)胞靜置步驟有助于確保細(xì)胞處于自然、未受刺激的狀態(tài)，從而更準(zhǔn)確地反映其正常的靶標(biāo)分析物分泌水平。靜置細(xì)胞的另一個(gè)重要作用是去除細(xì)胞碎片，確保更干凈的背景。

如何進(jìn)行細(xì)胞靜置處理呢？

1.分離細(xì)胞:首先分離好實(shí)驗(yàn)所需的PBMCs、T細(xì)胞、B細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞。

2.調(diào)整細(xì)胞密度:在分離和洗滌細(xì)胞后，測(cè)量細(xì)胞活力，并將細(xì)胞密度調(diào)整到適合靜置的水平。通常，細(xì)胞密度約為每ml培養(yǎng)基1-2百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。Mabtech建議將細(xì)胞放在50ml或15ml的無(wú)菌錐形管中，并稍微擰松蓋子，以便在培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行氣體交換。

3.靜置細(xì)胞:在37℃、含5% CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。讓細(xì)胞靜置至少一個(gè)小時(shí)，或者過(guò)夜。最佳靜置時(shí)間可能因細(xì)胞類(lèi)型和檢測(cè)的具體情況而異，需要進(jìn)行一些優(yōu)化。

4. 靜置期結(jié)束后，輕輕地重懸細(xì)胞，讓一些結(jié)塊的細(xì)胞碎片落到試管底部。避免結(jié)塊漂起，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的50 ml試管中進(jìn)行洗滌步驟。

5.離心洗滌細(xì)胞，倒出上清液。重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中，并重復(fù)一次洗滌步驟。

6.  再次檢測(cè)細(xì)胞活力，并將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整到ELISpot檢測(cè)所需的適當(dāng)水平。

溫馨提示：本文中的實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。

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