一、概述

1973年，美國Rockeller大學Steinmen和Cohn首先從小鼠脾細胞的分離中發現了表面具有很多樹枝狀的突起的細胞，將其命名為：樹突狀細胞（dendritic cell，DC）。DC細胞作為免疫前線的指揮官，是目前所知的機體內功能max的抗原提呈細胞，一個DC細胞能夠激活100-3000個T細胞，是巨噬細胞和B細胞的100-1000倍^[1]。DC細胞通過處理腫瘤抗原并將其呈遞給T細胞，將先天性免疫與適應性免疫聯系起來，從而啟動抗腫瘤免疫，因此DC細胞是機體免疫應答的始動者，在免疫應答的誘導中具有特殊的地位。

1、DC細胞來源

DC細胞是起源于骨髓并居住在外周和淋巴組織中的淋巴樣或髓系細胞。大多數DC由共同DC祖細胞(CDP)生成，CDP在FLT3L誘導下最終生成為cDC和pDC；一部分也會來源于造血干細胞的單核細胞，在GM-CSF和IL-4的誘導下產生外周血單核細胞來源DC^[2]。

所以體外培養的DC細胞來源可以是骨髓、外周血的單核細胞誘導生成；或骨髓、外周血來源的CD34+HSC骨髓多能造血干細胞誘導生成；或從血液、組織等樣本中直接分離。其中，外周血中CD14+單核細胞獲取較為便捷，誘導生成Mo-DC細胞是很經典的方法，不過Mo-DC無法再循環至淋巴結，并且與淋巴組織駐留樹突狀細胞(LT-DC) 存在差異^[3]；CD34+HSC細胞不太容易獲取，但可以誘導生成pDC、cDC1和cDC2；而直接從樣本中分離獲得的DC細胞很接近體內真實情況，不過產量一般比較低。另外一種新穎的DC細胞來源是，誘導多能干細胞iPSC/胚胎干細胞ESC也可誘導成DC細胞：iPSC分化成CD34+的造血干細胞后，通過添加GM-CSF、IL4、TNF-α、OK432的培養體系，可以分化成樹突狀細胞(iDC)，iDC可以直接在iPSC上基因編輯導入特定抗原基因，從而大大縮短DC孵育抗原并遞呈給T細胞的時間^[4]。當然，也可以直接購買商品化的DC細胞，方便快捷，品質有保障。

圖1 小鼠樹突狀細胞發育圖譜^[2]

2、DC誘導分化與培養

由于DC細胞的樣本來源以及誘導方法也比較龐雜，在這里我們舉三個例子：

1)  人骨髓CD34+細胞誘導生成DC^[5]

①飼養層細胞OP9的培養和接種

a、OP9細胞在75cm²培養瓶中培養至密度為4×10³-1×10⁴細胞/cm²， OP9培養基（αMEM，20%FBS，青霉素-鏈霉素），37°C，5%CO₂；

b、收獲OP9細胞，將2-3mL胰蛋白酶-EDTA溶液加入培養瓶中，37℃消化5-15min，在倒置顯微鏡下觀察細胞層，直到細胞變圓開始脫落。加入6-8mL OP9完quan培養基，終止消化，輕輕吹打細胞；

c、將細胞懸液轉移到15mL離心管中，125×g離心10min，棄上清液，將OP9細胞沉淀重懸在新鮮預熱培養基中，細胞密度為2.5×10⁴個細胞/mL；

d、按照每孔200μL（5000個細胞）分裝到96孔U底組織培養處理板中，在37°C、5%CO₂中培養。

②DC分化

a、吸出預接種OP9細胞的培養基，并用200μL CD34+細胞懸浮液（3000個細胞）替換，繼續培養；

b、第6天，每個孔中取出100μL培養基，并用100μL預熱的DC分化培養基αMEM（abs9506）, 10%FBS（abs972）, 1%penicillin-streptomycin（abs9244）, 100ng/mL Flt3L（abs04375）, 20ng/mL SCF（abs04178）, 20mg/mL GM-CSF（abs00839）替換；在第12-21天收獲細胞，并且可在第12天和第18天半量換液。人骨髓CD34+細胞誘導生成更多DC細胞亞型，大家可以參考圖2。

圖2 人骨髓CD34+細胞誘導生成更多DC細胞亞型匯總^[5]

文中部分相關產品：

2)  單核細胞誘導生成MoDC^[6]

①用培養基RPMI 1640（含10%FBS）調整富集的單核細胞濃度至5×10⁶cells/mL，鋪于24孔板上，同時加入重組人IL-4 （abs04698）(500U/mL)和GM-CSF（abs00839）(500U/mL)，于37℃，5%CO₂培養箱中培養；

②48h后，半量換液，同時補充重組人IL-4(500U/mL)和GM-CSF(500U/mL)，繼續刺激2天；

③第5天，可收獲未成熟的樹突細胞，即單核細胞來源樹突狀細胞(monocyte-Derived dendritic cells， MoDCs)，用于下游實驗（如成熟DC的激活）；

④成熟DC激活：LPS(0.5μg/mL)（abs47014848）、pha(10ng/mL)（abs47014910）、IL-6(10ng/mL)（abs04044）、IL-1β(10ng/mL)（abs00802）、PGE2(1μmol/L)（abs819421）刺激24-48h。

文中部分相關產品：

3)  IPSC/ESC誘導DC細胞^[7]

①IPS細胞(或ES細胞)向造血祖細胞的分化

a、當IPS或ES細胞達到70-80%密度時，使用Collagenase IV（abs47048003）在37°C、5%CO₂條件下消化40-60min，直至細胞團邊緣卷起，終止消化；

b、細胞團形成：將IPS或ES細胞團通過細胞篩網過濾，調整細胞團大小，形成含有50-100個細胞的細胞團；

c、如果IPS或ES細胞團要培養在小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)上，接種前需去除MEF；在37°C、5%CO2和5%O₂條件下培養，每天更換培養基，以形成擬胚體EB；

d、從第1天開始，根據分化天數準備相應的誘導培養基(d1,d2,d4,d6)；

e、在分化的第6至14天（IPS細胞）或第21至28天（ES細胞）期間，觀察到造血祖細胞從EB中出現。

圖3 D2-D6 EB分化階段培養基

②IPS細胞（或ES細胞）衍生造血祖細胞分化為DC亞群

a、將輻射滅活過的OP9細胞以1.2x10⁴cells/cm₂密度接種在涂有0.1%明膠的培養皿上；收集造血祖細胞，并通過40μm細胞篩網過濾以去除剩余的EB；調整細胞密度1x10⁶-1.5x10⁶cells/mL于DC分化基礎培養基中；

b、將細胞分為兩組，一組用于生成cDC1和cDC2（使用FSG4細胞因子組合），另一組用于生成cDC1和pDC（使用FSG細胞因子組合）；

在FSG4組中添加100ng/mL FLT3L（abs04375）、20ng/mL SCF（abs04178）、20ng/mL GM-CSF（abs00839）和20ng/mL IL-4（abs04698）；

在FSG組中添加100ng/mL FLT3L（abs04375）、20ng/mL SCF（abs04178）和10ng/mL GM-CSF（abs00839）；

c、將造血祖細胞懸液接種到OP9基質細胞上，進行共培養；每兩天進行一次半量換液；在分化的第4天至第7天，將逐漸出現DC形態。

文中部分相關產品：

3、DC細胞亞型鑒定

DC細胞亞群可以分為漿DC、1型髓樣DC、2型髓樣DC等，DC細胞不同亞型、標記物、細胞因子可以參考圖4。DC細胞亞型鑒定較常用的方法是流式，關于流式鑒定的基本內容大家可以參考《免疫細胞培養攻略之分型鑒定（三）》。

圖4 小鼠和人DC亞群的表面標記物、模式識別受體（PRR）、細胞因子^[8]

4、DC細胞熱門研究

DC細胞作為抗原呈遞能力max的免疫細胞，在抗腫瘤免疫中發揮著重要的作用，當DC細胞功能受損時，腫瘤細胞很有可能利用這一方面產生免疫逃逸，并且，腫瘤微環境也會釋放很多抑制因子，進而阻止DC祖細胞的正常分化，從而抑制T細胞的抗腫瘤反應^[9]。

圖5 DC細胞與腫瘤微環境^[9]

DC細胞的熱門研究很多：腫瘤浸潤DC細胞、髓系抑制細胞、DC疫苗、DC-CIK細胞療法、DC-T細胞療法等，在這里，小愛以流式分析小鼠結腸癌腫瘤浸潤DC亞型為例（圖6）^[10]：CD11c+MHCII+雙陽性髓系細胞→CD317+(pDC) → CD64+F4/80-(moDC) → CD103+CD11b?(cDC1)、 CD103-CD11b+(cDC2)。除了流式細胞術，想要研究腫瘤浸潤DC細胞的利器還有很多：質譜流式、單細胞測序等等（圖7）。

圖6 DC流式分析小鼠結腸癌腫瘤浸潤DC亞型圈門邏輯^[10]

圖7 腫瘤浸潤DC細胞研究思路匯總

參考文獻：

[1] Hart, D.N.J., Dendritic Cells: Unique Leukocyte Populations Which Control the Primary Immune Response. Blood, 1997. 90(9): p. 3245-3287.

[2] Anderson, D.A., et al., Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology, 2020. 21(2): p. 101-115.

[3] Balan, S., et al., Large-Scale Human Dendritic Cell Differentiation Revealing Notch-Dependent Lineage Bifurcation and Heterogeneity. Cell Reports, 2018. 24(7): p. 1902-1915.e6.

[4] Xue, D., et al., Induced pluripotent stem cell-derived engineered T cells, natural killer cells, macrophages, and dendritic cells in immunotherapy. Trends in Biotechnology, 2023. 41(7): p. 907-922.

[5] Lutz, M.B., et al., Guidelines for mouse and human DC generation. European Journal of Immunology, 2022. 53(11).

[6] Ulrich, H., et al., A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. Plos One, 2020. 15(4).

[7] Sontag, S., et al., Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPS Cells) and Embryonic Stem Cells (ES Cells) into Dendritic Cell (DC) Subsets. Bio-Protocol, 2017. 7(15).

[8] Macri, C., et al., Dendritic cell subsets. Seminars in Cell & Developmental Biology, 2018. 84: p. 11-21.

[9] Subtil, B., et al., The Therapeutic Potential of Tackling Tumor-Induced Dendritic Cell Dysfunction in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology, 2021. 12.

[10] Eich, C., et al., Isolation and high-dimensional flow cytometric analysis of tumor-infiltrating leukocytes in a mouse model of colorectal cancer. Frontiers in Immunology, 2024. 15.

今天講解就到這了，大家如有細胞培養問題，歡迎一起交流哦！

本期小愛推薦

Absin產品線：

爆款產品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細胞培養(類器官試劑盒+基質膠，胎牛血清+培養添加劑+細胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...

特色產品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...