Piezo1‐Mediated Mechanotransduction Contributes to Disturbed Flow‐Induced Atherosclerotic Endothelial Inflammation

Keywords: Piezo1; atherosclerosis; endothelial cells; inflammation; shear stress.

動脈粥樣硬化與心肌梗塞和中風密切相關，被認為是一種始于內皮細胞（EC）活化的慢性炎癥性疾病。血流剪切應力是指流動的血液對血管表面施加的摩擦力。在動脈樹的直線區域中由單向流動產生的層流剪切應力（LSS）是抗動脈粥樣硬化的，而由動脈分支或彎曲處的擾動流（DF）產生的振蕩剪切應力（OSS）是致動脈粥樣硬化的。如果長期暴露于 DF，EC 炎性細胞因子的表達，尤其是血管細胞粘附分子1（VCAM-1）和細胞間粘附分子1（ICAM-1）的表達會增加。內皮細胞的炎癥激活最終會促進并加速動脈粥樣硬化的發展。

Piezo1 是一種機械敏感蛋白，能夠將機械信號轉化為生物反應，其廣泛表達賦予 ECs 對血流剪切應力刺激的及時響應，這是血管各種生理和病理過程中的關鍵環節。然而，人們對 Piezo1 在心血管系統中的生物力學傳感作用知之甚少，尤其是在動脈粥樣硬化中，這與血流的剪切應力密切相關。

最近，在廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科及齊齊哈爾醫學院第二附屬醫院的一項聯合研究中，評估了 Piezo1 在體內動脈粥樣硬化中的作用。該團隊揭示了 Piezo1 在動脈粥樣硬化斑塊組織中上調，特別是在暴露于擾動流的 ECs 中；體外實驗表明，Piezo1 直接感應 OSS 的刺激，介導 Ca2+ 的內流并激活內皮炎癥。從機制上講，Piezo1 通過 Ca2+/CaM/CaMKII 通路激活粘著斑激酶（FAK）和 Src，導致 S127 位點的去磷酸化和 YAP（yes 相關蛋白）的核易位，最終觸發內皮炎癥。研究成果發表在 Journal of the American Heart Association 期刊題為“Piezo1‐Mediated Mechanotransduction Contributes to Disturbed Flow‐Induced Atherosclerotic Endothelial Inflammation”。

首先，實驗檢查了高脂飲食的動脈粥樣硬化 apoE-/- 小鼠主動脈中 Piezo1 的表達，發現其Piezo1 水平顯著上調。免疫熒光染色進一步顯示，Piezo1 上調，主要與動脈粥樣硬化病變中的內皮細胞共定位。然后驗證了 Piezo1 高表達與動脈粥樣硬化 DF 的關系，發現與主動脈弓的外曲率（層流區域）相比，主動脈弓的內曲率（擾動流區域）表現出更高水平的 Piezo1。為了進一步證實上述發現，構建apoE-/- 小鼠部分頸動脈結扎模型，局部產生 DF 和 OSS 以加速動脈粥樣硬化，發現與未結扎的層流側相比，暴露于結扎側頸動脈擾動流中的 ECs 表現出更高水平的 Piezo1。這表明，Piezo1 在 ApoE-/- 小鼠的動脈粥樣硬化斑塊和擾動流暴露的內皮區域中高表達。

為了探索 Piezo1 在體內動脈粥樣硬化中的功能，對高脂飲食的apoE-/- 小鼠注射 GsMTx4（Piezo1 抑制劑），評估Piezo1 對動脈粥樣硬化的長期影響。油紅 O 染色和蘇木精-伊紅染色顯示，注射 GsMTx4 后，小鼠的總體斑塊負荷和主動脈根部斑塊面積顯著減少（圖1 A-D）。然后，通過頸動脈結扎誘導 DF 動脈粥樣硬化模型，驗證 Piezo1 在 DF 相關動脈粥樣硬化中的作用。同樣發現，抑制 Piezo1 顯著降低了與 DF 相關的頸動脈斑塊病變的進展（圖1 E、F）。

此外，還探討了 Piezo1 在內皮炎癥中的作用。顯然，Piezo1 抑制劑減弱了動脈粥樣硬化炎癥標志物 VCAM-1 和 ICAM-1 的表達（圖1 G-I）。免疫熒光染色進一步證實了這一發現（圖1 J、K）。在部分頸動脈結扎模型中，DF 誘導的 VCAM-1 過表達被Piezo1 的抑制逆轉（圖1 L、M）。這些結果表明，抑制 Piezo1 可延緩長期和擾動流誘導的動脈粥樣硬化斑塊進展和內皮炎癥。

圖1    抑制 Piezo1 可延緩長期和擾動流誘導的動脈粥樣硬化斑塊進展和內皮炎癥。

接下來，為了研究 Piezo1 在 ECs 中如何響應 DF 發揮作用，將體外 HUVECs 組裝到平行板流通室中，并加載 OSS（0.5±4 dyn/cm2），模擬作用于血管內膜的 DF 刺激。當保持靜態時，Piezo1 在 HUVECs 中擴散分布，但當受到 OSS 刺激時，出現局部高密度堆積（圖2 A）。考慮到Piezo1 激活時 Ca2+ 可滲透性，因此檢測了 Ca2+ 內流以評估 OSS 是否可以激活 Piezo1。結果顯示，與靜態狀態相比，OSS 刺激促進細胞內 Ca2+ 積累，這與 LSS 和 Piezo1 激動劑 Yoda1 的作用一致，但與抑制劑 GsMTx4 相反（圖2 B-C）。

然后，在 HUVECs中進行 Piezo1 靶向沉默。Piezo1 沉默顯著抑制 OSS 介導的 Ca2+內流（圖2 D-E）。隨后，將注意力轉向 Piezo1 在 OSS 誘導的內皮炎癥中的作用，發現OSS 增加了內皮炎癥標志物 VCAM-1 和 ICAM-1 的 mRNA 水平，然而，Piezo1 的缺失部分抵消了這種效應（圖2 F-G）。這些數據說明，Piezo1 響應 OSS 促進內皮炎癥激活。

根據上述發現，繼續研究 Piezo1 與內皮炎癥之間的潛在聯系。據報道，YAP 是一種 OSS 敏感的轉錄因子，可被 OSS 激活以觸發內皮炎癥和動脈粥樣硬化。研究發現，OSS 誘導 YAP 在絲氨酸 127 位點的時間依賴性去磷酸化。免疫熒光染色也顯示暴露于 OSS 后 HUVECs 中具有強烈的 YAP 核定位。然而，當 Piezo1 被刪除時，發現 OSS 誘導的 YAP 激活被部分抑制，證明 YAP 是 Piezo1 的重要下游因子。

與體外結果一致，體內觀察發現，部分頸動脈結扎誘導的 DF 導致內皮細胞中 YAP 表達更高，而 Piezo1 抑制劑 GsTMx4 減輕了 YAP 的上調。挽救實驗發現，Piezo1 沉默介導的 VCAM-1 和 ICAM-1 的下調被 YAP 過表達逆轉。這表明，Piezo1 通過 YAP 激活促進內皮炎癥。

圖2    Piezo1 響應振蕩剪切應力促進內皮炎癥激活。

Piezo1 如何將 OSS 機械信號傳輸給 YAP 引起了研究人員的注意。FAK 和 Src 激酶家族在細胞機械信號傳感中起著重要作用。以往研究證實Piezo1 激活可調節 FAK 活性，因此，實驗研究了 FAK/Src 是否參與 HUVECs 中 OSS 介導的 Piezo1 激活。結果表明，Piezo1 的缺失降低了 OSS 和 Yoda1 誘導的 Tyr397（p-FAK Y397）和 Tyr419（p-Src Y419）位點的 FAK 磷酸化水平。免疫沉淀和熒光共定位分析顯示，Piezo1 缺失降低了 FAK/Src 的共沉淀和共定位，表明 Piezo1 影響 FAK/Src 的結合。

已知 FAK 和 Src 可在機械反應中激活 YAP。因此，推測抑制 FAK 和 Src 激酶活性可能會挽救 Piezo1 誘導的 YAP 激活和炎癥表型。與此一致，用 FAK 抑制劑（PF-573228）和 Src 抑制劑（PP2）處理減少了 Yoda1 誘導的 YAP S127 去磷酸化和 VCAM-1 表達。這表明，Piezo1 通過 FAK/Src 激酶激活 YAP。

鑒于 Piezo1 通道的激活允許大量的 Ca2+內流，經典的鈣信號通路 Ca2+/CaM/CaMKs（Ca2+/calmodulin/calmodulin‐dependent protein kinases）可能是 Piezo1 激活與其下游事件之間的重要聯系。將CaMKK 抑制劑 STO-609和CaMKII 抑制劑 KN-93 分別添加到 HUVECs 中，發現只有 KN-93 抵消了 Piezo1 介導的 YAP S127 去磷酸化（圖3 A、B）。此外，用 Ca2+ 螯合劑 BAPTA、CaM 抑制劑 Trifluoperazine 和 CaMKII 抑制劑 KN-93處理 HUVECs。結果顯示，Yoda1 誘導的 YAP 去磷酸化和 VCAM-1 表達被 Ca2+/CaM/CaMKII 抑制劑抑制（圖3 C-E）。

最后，進一步測試 Ca2+/CaM/CaMKII 和 FAK/Src之間的聯系，將HUVECs 用 Ca2+、CaM 和 CaMKII 抑制劑處理，并評估 FAK 和 Src 的磷酸化，發現 FAK 和 Src 的磷酸化受到抑制（圖3 F-H）。此外，抑制 CaMKII 激酶活性導致 FAK 和 Src 之間的相互作用減弱（圖3 I-J）。這些數據表明，Piezo1 介導的 YAP 激活和內皮炎癥依賴于 Ca2+/CaM/CaMKII‐FAK/Src 軸。

圖3    Piezo1 介導的 YAP 激活和內皮炎癥依賴于 Ca2+/CaM/CaMKII‐FAK/Src 軸。

圖4     Piezo1 響應 OSS 促進動脈粥樣硬化性內皮炎癥的示意圖。

致動脈粥樣硬化 DF/OSS 激活內皮 Piezo1。Piezo1 的激活允許 Ca2+ 內流，隨后激活 Ca2+/CaM/CaMKII 信號通路和下游激酶 FAK/Src。這個過程有導致 YAP S127 去磷酸化，并最終觸發內皮炎癥，推動動脈粥樣硬化的進展。

綜上所述，該研究表明，Piezo1 可能是動脈粥樣硬化的潛在治療靶點。研究闡明了 Piezo1 在 OSS 介導的內皮炎癥中的機械轉導作用，確定了 Piezo1-Ca2+/CaM/CaMKII-FAK/Src-YAP 軸作為一種新的信號級聯反應。然而，目前尚不確定其他因素，例如膜受體串擾、銜接蛋白和激酶之間的相互作用以及其他轉錄因子的協同或抑制作用，是否也參與 Piezo1 介導的機械轉導途徑。構建更完整的內皮機械轉導網絡值得未來進一步探索。

參考文獻：Lan Y, Lu J, Zhang S, Jie C, Chen C, Xiao C, Qin C, Cheng D. Piezo1-Mediated Mechanotransduction Contributes to Disturbed Flow-Induced Atherosclerotic Endothelial Inflammation. J Am Heart Assoc. 2024 Nov 5;13(21):e035558. doi: 10.1161/JAHA.123.035558. Epub 2024 Oct 25. PMID: 39450718.

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