摘要本文介紹了使用二維液相色譜同時檢測飼料中維生素 A、D3、E 的分析方法。前處理使用安捷倫表面親水反相苯乙烯二乙烯基苯聚合物 Bond Elut Plexa 對飼料堿性皂化液進行富集和凈化，方法簡單，高效、環保。在相應的濃度范圍內，維生素 A、D3、E 的線性相關系數均大于 0.999。5 種飼料在不同的加標濃度下，維生素 A、D3、E 的平均加標回收率分別在 91.9%–112.1%、87.4%–122.9% 和 89.4%–116.7% 之間，相對標準偏差分別在1.0%–11.5%、0.2%–10.5% 和 0.9%–9% 之間，準確度和精密度良好，該方法適用于同時檢測飼料中的維生素 A、D3、E。

前言脂溶性維生素 A、D、E 作為一類有機微量營養物質，有促進動物生長、調節代謝和增強動物免疫等作用。通常情況下，畜禽不能或難以合成滿足自身需要的足量維生素，因此需要在飼料中添加適量維生素，以滿足養殖業對于飼喂畜禽快速、健康生長的需求[1]。中華人民共和國農業部公告第 2625 號公告[2] 制定了飼料中維生素的推薦用量和最高用以指導飼料生產企業根據畜禽品種和不同生長階段調控維生素的添加量。根據現行的國家標準，維生素 A、D3、E 的檢測是分開的三個標準[3-5]，檢測成本較高，耗時且工作量大。因此，有必要建立一種可以同時檢測維生素A、D3、E 的方法，實現飼料中脂溶性維生素含量的準確測定，對飼料中維生素含量進行監控，掌控飼料中含量，使其可以既滿足畜禽營養需求，又符合國家規范要求。飼料中維生素 A、D3、E 的前處理方法，通常包括皂化、提取和濃縮等步驟，皂化的主要目的是將維生素從制劑包被的狀態中游離出來同時將酯形式的維生素水解為醇便于檢測，皂化步驟通常是一步。對于提取和濃縮，一般有液液萃取和固相萃取兩種方法，傳統的液液萃取方式采用石油醚，相比于液液萃取消耗溶劑量大，環境不友好，耗時的缺陷而言，固相萃取具有節省溶劑，集凈化和濃縮于一體且能實現良好的凈化效果等優勢。Agilent Bond Elut Plexa SPE 柱，是表面羥基化的聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物填料，易被水潤濕且流速優異，可耐受高pH，是比較理想的選擇。對于儀器方法，維生素 A、E 可使用一維 DAD 檢測，而維生素 D3 添加量較低，靈敏度有限且易受基質干擾，是制約維生素 A、D3、E 同時檢測的難點所在。二維液相色譜具有自動化程度高且峰容量大，可顯著降低復雜樣品的基質干擾等特點，已得到廣泛的應用，安捷倫目前已經有多篇關于食品中維生素 A、D、E 同時檢測的應用[6-9]，其中包括在線 SPE-2D中心切割法對皂化液進行自動凈化，富集，以及維生素 A、D、E 的同時分析。本文在此基礎上，使用 Agilent Bond Elut Plexa離線固相萃取方式對皂化液進行凈化和富集，并結合二維液相色譜，建立了同時檢測飼料中三種脂溶性維生素 A、D3、E 含量的方法，為用戶提供更多，更靈活的方法選擇。

實驗部分試劑和樣品實驗用乙腈、甲醇均為色譜純，購于北京迪馬科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鉀、L-抗壞血酸、二丁基羥基甲苯 (BHT) 為分析純。維生素 A、維生素 A 乙酸酯、維生素 E、維生素 E 乙酸酯和維生素 D3 標準品購于曼哈格公司 (BePure)。飼料樣品為市售產品。標準品制備稱取一定量上述標準品，以甲醇為溶劑，配制于棕色試劑瓶中，密封后避光儲存于 –18 °C 下。臨用前將儲備溶液回溫至室溫，參考國標方法進行濃度校正。

儀器和設備儀器具體配置如下：Agilent 1260 Infinity II 泵（第一維泵，部件號 G7111；第二維泵，部件號 G1312B）；Agilent 1260 InfinityII 自動進樣器（部件號 G7129A）；Agilent 1260 Infinity II 柱溫箱（部件號 G7116A）； Agilent 1260 Infinity II VWD（部件號G7114B，第一維檢測器）Agilent 1260 Infinity II DAD 檢測器（G7117C，第二維檢測器）。色譜柱采用 Agilent Poroshell HPH-C8（4.6 × 50 mm, 2.7 µm，部件號 699975-706）、Poroshell 120 EC-C18（4.6 × 5 mm, 2.7 µm，部件號 820750-911）和 Zorbax Eclipse PAH（2.1 × 100 mm,3.5 μm ，部件號959793-918）。樣品前處理采用 Agilent Bond Elut Plexa（200 mg，6 mL；部件號12109206）、Agilent ValueLab 尼龍微孔濾膜（0.2 μm，13 mm；部件號 5191-4286）。

維生素標樣制備準確取適量維生素 A、D3、E 標準工作液，用乙腈配制系列標準溶液，其中維生素 A 的濃度分別為 0.2、0.5、1、5、10、20、50 IU/mL，維生素 D3 的濃度分別為 0.1、0.5、1、5、10、50 IU/mL，維生素 E 的濃度分別為 0.0005、0.001、0.005、0.05、0.1、0.2、0.5 IU/mL，臨用現配。

樣品前處理稱取一定量飼料樣品，加入乙醇和氫氧化鉀溶液皂化后使用Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取柱對皂化液中維生素 A、D3、E進行富集和凈化，用二維液相色譜測定，如圖 1 所示為樣品前處理操作流程，表 1 所示為液相色譜分析條件。

結果與討論Bond Elut Plexa 固相萃取條件優化Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取柱，是表面羥基化的聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物填料，能夠耐受皂化液的強堿條件，易被水潤濕且流速佳，適合飼料皂化液中富集和凈化維生素 A、D3、E。為了確定最佳的固相萃取條件，本應用從淋洗溶劑（5%、10%、20%、40%、50% 甲醇水）、洗脫溶劑（乙腈、甲醇、乙酸乙酯）和洗脫體積（2 mL、3 mL、4 mL）三個方面對固相萃取條件進行優化。采用飼料皂化液加入適量的維生素 A、D3、E 標樣的方法，分別采用上述不同的淋洗溶劑、洗脫溶劑和洗脫體積做相應的處理（在確定最佳的條件之前，均使用 10% 甲醇水淋洗和4 mL 乙腈洗脫的條件），結果分別見圖 2A、2B。由圖可知，使用不同的淋洗溶劑，回收率結果沒有明顯差異，但考慮到上樣皂化液中含有高濃度的氫氧化鉀溶液，采用高比例水淋洗有更佳的去除效果，因此選擇 10% 甲醇水溶液作為淋洗溶液。對于不同的洗脫溶劑，乙腈對維生素 A、D3、E 的洗脫效果優于甲醇和乙酸乙酯。因此進一步比較確定了乙腈的使用量，使用 3 mL 即可將維生素 A、D3、E 洗脫，最終確定了使用 10% 甲醇水淋洗，并使用 3 mL 乙腈洗脫。