中藥注射劑評價特色分析方案丨LCMSMS測定注射劑對細胞培養上清液中組胺含量
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l 類過敏反應
類過敏反應是中藥注射劑臨床應用過敏反應常見類型,是非經典途徑的免疫反應,其主要機制是細胞受到外界物質刺激發生反應后分泌組胺、蛋白酶和花生四烯酸等過敏性介質。組胺則是過敏反應中最主要的活性過敏介質之一,可導致機體產生潮紅、頭痛、水腫、低血壓以及休克等癥狀。通過中藥注射劑對細胞培養液反應,檢測組胺等過敏介質的含量,對判斷中藥注射劑發生類過敏的風險具有一定的應用價值。
l 組胺檢測方法
由于生物樣品中組胺的含量低,量化組胺需要高靈敏度的分析方法。目前,組胺的檢測方法主要有 ELISA 檢測法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜和離子色譜法等。
l 分析條件
液相條件
HILIC色譜柱(2.1 mm I.D.x150 mm L.3 um)
流動相:A 相 -20mM 乙酸銨 +0.1% 甲酸水溶液 B相-乙腈
流速:0.4 mL/min
柱溫:40℃
進樣量:5 μL
洗脫方式:等度洗脫,A:B=10:90(V/V)
質譜條件
離子化模式:ESI,正離子模式
離子噴霧電壓:+4.5 kV
霧化氣流速:氮氣 3.0 L/min
干燥氣流速:氮氣 15 L/min
碰撞氣:氬氣
加熱模塊溫度:400℃
掃描模式:多反應監測(MRM)
駐留時間:50 ms
延遲時間:3 ms
DL管溫度:250℃
MRM優化參數
l 樣品的處理
取培養一段時間后的細胞培養液,注射入中藥注射試劑刺激細胞后取細胞上清液,并在 0~4℃以3000 r/min 離心10 min,取上清液至進樣小瓶中,從中取 100 μL 至另一離心管中加入 20 μL內標溶液,加入200 μL乙腈,充分挑勻室溫 15000 rpm,15 min 再次離心。取 100 μL 上清液加入 900 μL超純水充分振勻后直接上樣分析。
l 分析結果
標樣的MRM色譜圖(10ng/mL)
線性關系
組胺校準曲線
重復性實驗
配制目標物濃度分別為 1、10、100 ng/mL 的混合標樣,平行測定各3次,考察儀器的重復性,保留時間和峰面積重復性結果如下表所示,儀器重復性良好。
回收率及精密度實驗
稱取組胺標準品,以陰性細胞上清液溶解,使其質量濃度為1、10、100 ng/mL,按 前述“0~4℃以3000 r/min 離心10 min……取 100 μL 上清液加入 900 μL超純水充分振勻后直接上樣分析。”處理后,對樣品進行3個加標水平的回收率實驗,每個加標水平平行測定3次, 3 個加標水平的平均回收率為 90.4%~93.8%,相對標準偏差為 4.75%~5.78%。結果表明方法的回收率和精密度均較好。
LC-MS/MS測定中藥注射劑對細胞培養上清液組胺含量的分析方法,方法穩定、特異性和靈敏度均較高,重復性好。因此,本方法可用于測定中藥注射劑對細胞培養上清液中組胺含量,對判斷中藥注射劑發生過敏的風險具有一定的應用價值。
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