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中藥注射劑評價特色分析方案丨LCMSMS測定注射劑對細胞培養上清液中組胺含量

來源:島津企業管理(中國)有限公司   2024年11月12日 16:24  

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l                      類過敏反應

類過敏反應是中藥注射劑臨床應用過敏反應常見類型,是非經典途徑的免疫反應,其主要機制是細胞受到外界物質刺激發生反應后分泌組胺、蛋白酶和花生四烯酸等過敏性介質。組胺則是過敏反應中最主要的活性過敏介質之一,可導致機體產生潮紅、頭痛、水腫、低血壓以及休克等癥狀。通過中藥注射劑對細胞培養液反應,檢測組胺等過敏介質的含量,對判斷中藥注射劑發生類過敏的風險具有一定的應用價值。 

 

l                      組胺檢測方法

由于生物樣品中組胺的含量低,量化組胺需要高靈敏度的分析方法。目前,組胺的檢測方法主要有 ELISA 檢測法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜和離子色譜法等。

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l                      分析條件

液相條件

HILIC色譜柱(2.1 mm I.D.x150 mm L.3 um)

流動相:A 相 -20mM 乙酸銨 +0.1% 甲酸水溶液  B相-乙腈

流速:0.4 mL/min

柱溫:40℃

進樣量:5 μL

洗脫方式:等度洗脫,A:B=10:90(V/V)

質譜條件

離子化模式:ESI,正離子模式

離子噴霧電壓:+4.5 kV

霧化氣流速:氮氣 3.0 L/min

干燥氣流速:氮氣 15 L/min

碰撞氣:氬氣

加熱模塊溫度:400℃

掃描模式:多反應監測(MRM)

駐留時間:50 ms

延遲時間:3 ms

DL管溫度:250℃

 

MRM優化參數

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l                      樣品的處理

取培養一段時間后的細胞培養液,注射入中藥注射試劑刺激細胞后取細胞上清液,并在 0~4℃以3000 r/min 離心10 min,取上清液至進樣小瓶中,從中取 100 μL 至另一離心管中加入 20 μL內標溶液,加入200 μL乙腈,充分挑勻室溫 15000 rpm,15 min 再次離心。取 100 μL 上清液加入 900 μL超純水充分振勻后直接上樣分析

 

l                      析結果

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標樣的MRM色譜圖(10ng/mL)

 

線性關系

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組胺校準曲線

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重復性實驗

配制目標物濃度分別為 1、10、100 ng/mL 的混合標樣,平行測定各3次,考察儀器的重復性,保留時間和峰面積重復性結果如下表所示,儀器重復性良好。

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回收率及精密度實驗

稱取組胺標準品,以陰性細胞上清液溶解,使其質量濃度為1、10、100 ng/mL,按 前述“0~4℃以3000 r/min 離心10 min……取 100 μL 上清液加入 900 μL超純水充分振勻后直接上樣分析。”處理后,對樣品進行3個加標水平的回收率實驗,每個加標水平平行測定3次, 3 加標水平的平均回收率為 90.4%~93.8%,相對標準偏差為 4.75%~5.78%。結果表明方法的回收率和精密度均較好。

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LC-MS/MS測定中藥注射劑對細胞培養上清液組胺含量的分析方法,方法穩定、特異性和靈敏度均較高,重復性好。因此,本方法可用于測定中藥注射劑對細胞培養上清液中組胺含量,對判斷中藥注射劑發生過敏的風險具有一定的應用價值。

 

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