（一）摘 要

基于腫瘤類器官的藥物敏感性預測是一種新的精準醫學方法，在癌癥治療中有著廣泛的應用，并受到越來越多的關注。在癌癥領域，傳統的類器官培養方法通常需要超過2周~3周的培養期。培養時間極大地限制了腫瘤類器官應用和患者的臨床診療黃金期。

全國建院較早的六所腫瘤醫院之一，山西省腫瘤醫院/中國醫學科學院腫瘤醫院山西醫院/山西醫科大學附屬腫瘤醫院和自貢第四人民醫院等，應用了英國Kirkstall動態類器官培養微生理系統，以縮短乳腺癌類器官的培養時間，同時保持其組織學特性和藥物敏感性特征。

（二）研 究 發 現

利用奧拉帕尼、卡培他濱、順鉑、吉西他濱、戈沙妥珠單抗（SN-38替代品）和法瑪新藥物霉素對Dome組類器官進行藥物刺激研究。三種類器官模型顯示對藥物霉素敏感，并顯示了人類使用的良好治療結果。其中，BC1和BC2患者在乳房切除術后給予藥物阿霉素化療，隨訪10個月時未發現腫瘤復發。BC3患者采用藥物霉素進行新輔助治療，治療6個周期后，腫瘤大小從2.41*1.91 cm到1.46*1.24 cm。

（三）乳腺癌類器官的培養關鍵實驗步驟

1. 組織收集：

- 從三名患有浸潤性導管乳腺癌的患者身上獲取腫瘤組織樣本。

- 樣本采集經山西省級癌癥醫院倫理委員會審查和批準（記錄號KY2023039）。

- 所有研究方法均使用獲批的方法進行。

- 所有樣本的收集均獲得了患者的書面知情同意，并符合所有相關的倫理規定，包括赫爾辛基宣言。

- 組織樣本在處理和分析前進行了去標識化處理。

2. 建立和培養乳腺癌類器官：

- 從組織中去除明顯的結締組織，從視覺上異常的區域切取一塊組織用于石蠟包埋。

- 將剩余組織切成大約1mm3的小塊，并使用含有10µM Y-27632和2mg/mL I型膠原酶的先進DMEM/F12在37°C恒溫搖床中分散。

- 搖動30分鐘到1小時，期間每5到10分鐘用Pasteur吸管吹打幾次。

- 向收集的濾液中加入等體積的含有2% FCS的先進DMEM/F12。

- 離心后，用Matrigel重懸細胞沉淀，并在24孔細胞培養板中每滴40µL進行接種。

- 在37°C下孵育20分鐘，待滴液固化后，加入500µL的乳腺癌類器官培養基（KCJ-7, KINGBIO）并繼續在37°C 5%CO2條件下培養。

- 每3天更換一次培養基。

- 每7-15天消化并傳代一次，使用Dispase II（17105041, Gibco）回收類器官，并使用Accutase（A1110501, Gibco）將類器官解離成單細胞。

3. 實驗前準備：

- 實驗所用的乳腺癌類器官應高于兩代且低于五代。

- 使用英國Kirkstall Quasi Vivo® 動態系統進行流體培養。

- 實驗前將類器官解離成單細胞，并在每100µL Matrigel中接種20000個細胞。

4. 免疫組化染色：

- 使用常規方法進行組織和類器官的固定、石蠟包埋、切片、HE染色和IHC染色。

- 用于免疫組化染色的抗體包括PR（Abcam, ab32085）、ER（Abcam, ab108398）、HER2（Abcam, ab134182）、CK7（Abcam, ab181598）、GATA3（Abcam, ab199428）、E-cadherin（Abcam, ab40772）、Ki-67（Abcam, ab15580）。

- 使用Nikon ECLIPSE E100顯微鏡MshOt MS60獲取圖像，并使用Adobe Photoshop進行圖像處理。

5. 基因表達分析：

- 通過RT-qPCR測量基因表達水平。

- 使用Trizol（beyotime, R0016）提取總RNA，使用PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa, RR036A）進行逆轉錄，并使用TB Green Advantage qPCR premixes（TaKaRa, 639676）進行qPCR反應。

6. 類器官增殖實驗：

- 使用Alamar Blue（YEASEN, 40202ES80）進行類器官增殖實驗。

- 將染料溶液按比例加入類器官培養基中，反應時間為3小時。

- 在檢測期間，將染料溶液移入96孔板中，使用無內容物的凝膠滴在24孔板中作為陰性對照進行染色，并使用100%降低的Alamar Blue溶液作為陽性對照。

- 讀取595nm和630nm處的吸光度值，并根據制造商的說明計算降低率。

7. 類器官直徑測量：

- 隨機選擇100倍視野下的3個視野，測量并計數視野內所有清晰可見的類器官。

- 每5天測量一次。

8. 藥物篩選：

- 使用CellTiter-Glo（Promega, G9241）對類器官進行藥物敏感性分析。

- 這些藥物包括奧拉帕尼（HY-10162, MCE）、卡培他濱（5'-氟尿嘧啶替代品）（100187, National Institutes for Food and Drug Contro）、順鉑（S1166, selleck）、吉西他濱（100622, National Institutes for Food and Drug Contro）、（HY-13704, MCE）和（130560, National Institutes for Food and Drug Contro）。

- 使用Dispase II收集類器官。使用Accutase將類器官消化成單細胞。

- 在含有5% Matrigel的類器官培養基的384孔板中每孔接種1,000個細胞。

- 培養過夜后，加入藥物庫存溶液。

- 藥物孵育3天后，使用CellTiter-Glo檢測法根據制造商的說明定量細胞活性。

9. 統計分析：

- 數據以均值±標準差表示。使用Shapiro-Wilk檢驗進行正態性檢驗。

- 使用雙尾學生t檢驗、Wilcoxon檢驗和Kruskal-Wallis檢驗進行比較分析。

- p < 0.05表示顯著，除非另有說明。

- 星號數量表示不同程度的統計顯著性（*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001）。

- 所有數據分析和圖形均使用GraphPad Prism 8進行。

這些步驟概述了從樣本收集到類器官培養、藥物篩選和數據分析的全過程。參考文獻：Jun Yang et al.Posted Date: March 15th, 2024 .DOI

（四）討論與展望

在這篇文章中，作者闡述了microfluidic systems在癌癥類器官培養中的應用，這些應用展示了動態仿生類器官培養系統在癌癥研究和治療開發中的潛力，特別是在模擬復雜的腫瘤微環境和進行個性化醫療方面。

1. 模擬腫瘤微環境：動態仿生類器官培養系統能夠創建一個模擬體內腫瘤微環境的平臺，用于研究腫瘤細胞與微環境之間的相互作用。

2. 藥物篩選：動態仿生類器官培養系統可以用來進行高通量的藥物篩選，通過集成的微流體通道和芯片模擬腫瘤與血管網絡的相互作用，評估藥物的輸送和腫瘤生長。

3. 癌癥進展研究：通過在動態仿生類器官培養系統技術平臺上創建血管化腫瘤類器官模型，研究者可以觀察和分析腫瘤細胞的侵潤、血管生成以及腫瘤細胞的轉移。

4. 個性化醫療：動態仿生類器官培養系統可以用于個性化醫療研究，通過模擬特定患者的腫瘤微環境，測試患者特異性的癌癥治療方法。

5. 提高實驗的標準化和可重復性：動態仿生類器官培養系統有助于實現癌癥類器官培養的標準化，通過精確控制培養條件和環境參數，減少實驗之間的變異性。

6. 三維培養和細胞間相互作用：動態仿生類器官培養系統可以支持三維細胞培養，允許研究者研究腫瘤細胞與非腫瘤細胞（如成纖維細胞、免疫細胞）之間的相互作用。

7. 長期培養和擴增：微流控類器官芯片微生理系統提供了一種方法，用于長期培養和擴增癌癥類器官，同時保持其遺傳和表型特征。如小編正在科普的英國Kirkstall Quasi Vivo培養系統

8. 模擬腫瘤的動態變化：通過該動態仿生類器官培養技術，可以模擬腫瘤在治療過程中的動態變化，包括對藥物的反應和產生耐藥性。

9. 集成多個器官芯片：可以用于連接多個器官芯片（例如英國Kirkstall 智能自動化類器官芯片培養微生理系統），模擬多個器官之間的相互作用和藥物的全身效應。

（五）附《2025年度國家自然科學基金項目指南》征訂通知