估計(jì) EV的 數(shù)量、確定 EV 的存在以及評(píng)估EV 制備中非 EV 組分的份額和影響等都需要對(duì)EV進(jìn)行表征。EV的表征面臨著小粒徑、尺寸異質(zhì)性和分子異質(zhì)性、缺乏通用 EV 識(shí)別方法以及許多測(cè)量技術(shù)的非 EV 特異性的挑戰(zhàn)。沒有任何一種測(cè)量或方法能夠滿足所有 EV 表征的要求，因此建議使用正交方法（即沒有相同測(cè)量限制的方法）彼此驗(yàn)證，也就是說EV的表征參數(shù)作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA) 推薦采用兩種或兩種以上不同原理的方法檢測(cè)同一指標(biāo)。
EV 的總體組成（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和其他生物分子等的含量及比例）因 EV 來源而異。雖然這些單個(gè)分子類別的測(cè)量可用于估計(jì) EV 豐度，但這些值不一定與 EV 濃度全部相關(guān)，而且源材料之間也不存在普遍性；因此，它們不應(yīng)用作 EV 濃度的衡量標(biāo)準(zhǔn)。正如沒有單一分子的檢測(cè)可以量化所有 EV 一樣，也沒有 EV 或 EV 亞型的通用分子標(biāo)記。必須根據(jù)來源特異性和類型特異性的證據(jù)來選擇特定的標(biāo)記。目前，尚無已知的通用標(biāo)記可以識(shí)別所有EV，無論其來源如何。對(duì)于所謂的外泌體，這些標(biāo)記的普遍性尚不清楚或不被接受。請(qǐng)注意，涉及四次跨膜蛋白 CD9、CD63 和 CD81 的基于親和力的方案對(duì)于作為 EV 亞型的外泌體并不具有特異性；使用針對(duì)這些四次跨膜蛋白中的某一個(gè)的抗體富集的EV群體并不能不全面覆蓋所有的分子組成。此外，并非所有 EVs都表達(dá)這些蛋白標(biāo)志物，因此四次跨膜蛋白富集并不能捕獲所有 EVs。檢測(cè)同一表征參數(shù)的正交方法（不止一種原理的方法）不太可能具有相同的偏差；例如，同時(shí)通過光學(xué)方法與非光學(xué)方法分別推導(dǎo)和檢測(cè)EV的直徑。使用正交方法對(duì) EV 樣本進(jìn)行表征，對(duì)于證明共分離物與生物標(biāo)志物或功能發(fā)現(xiàn)無關(guān)也至關(guān)重要。由于許多EV表征方法不是特定適用于EV的，或者無法檢測(cè)所有的EV，因此需要將方法和結(jié)果透明公布以確保EV數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。
EV 的數(shù)量和體積測(cè)量一同定義了數(shù)濃度（以particles/mL 為單位），這是一種被廣泛報(bào)道并使用的指標(biāo)。然而，它通常不可靠，因?yàn)樵S多技術(shù)缺乏對(duì)EV的特異性和對(duì)所有EV的敏感性。ISEV 嚴(yán)格和標(biāo)準(zhǔn)化EV參考材料工作組最近概述了測(cè)量技術(shù)的考慮因素，以及該領(lǐng)域在面對(duì)可追溯測(cè)量、開發(fā)和報(bào)告良好表征的EV參考材料方面所面臨的挑戰(zhàn)。這項(xiàng)工作的一個(gè)關(guān)鍵亮點(diǎn)是需要公布檢測(cè)方法的 LOD，從而允許其他人驗(yàn)證結(jié)果，而不管靈敏度限制如何。通過使用正交方法可以提高 EV 濃度測(cè)量的可信度，每種方法都具有確定的 LOD，例如檢測(cè)光散射強(qiáng)度（如NTA）、熒光強(qiáng)度（如FCM）和物理大小（如RPS），因?yàn)檎环椒]有相同的測(cè)量限制。例如，電阻脈沖感應(yīng) (RPS) 技術(shù)，就可以用粒徑來表示 LOD。對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)等光學(xué)技術(shù)，LOD 可以用源自光散射光學(xué)模型的直徑或源自熒光強(qiáng)度的等效可溶性熒光團(tuán) (MESF) 分子來報(bào)告。這些方法可以在不同儀器和靈敏度之間產(chǎn)生一致的數(shù)據(jù)。由于顆粒檢測(cè)涉及的變量較多，因此目前尚無方法為納米顆粒跟蹤分析 (NTA)、動(dòng)態(tài)光散射 (DLS) 或成像流式細(xì)胞術(shù)得出可追溯的 LOD。對(duì)于無法區(qū)分 EV 與其他潛在共分離物或污染物的技術(shù)，無論上游分離步驟如何，都建議將濃度報(bào)告表示為“顆粒濃度或 EP 濃度”而不是“EV 濃度”。EV 大小（以納米半徑或直徑為單位）的測(cè)量依賴于球形度或遷移率等假設(shè)，并且輸出結(jié)果可能受到上游變量的影響。常見的高通量方法，包括流式細(xì)胞術(shù)、NTA、RPS、多角度光散射和動(dòng)態(tài)光散射 (DLS) 都假設(shè) EV 是球形的。雖然“大小”和“直徑”經(jīng)常在測(cè)量方法之間互通使用，但它們的推導(dǎo)方式也可能導(dǎo)致測(cè)量技術(shù)間的一致差異。例如，依賴于顆粒布朗運(yùn)動(dòng)的技術(shù)（如 NTA 或 DLS）測(cè)量的是流體動(dòng)力學(xué)直徑，與冷凍電鏡等成像方法相比，會(huì)導(dǎo)致顆粒大小估計(jì)過高。而很少有方法能夠在整個(gè)EV可能的直徑范圍內(nèi)（從幾十納米到微米）精確測(cè)量 EV 尺寸。例如，雖然冷凍電鏡的高分辨率成像是最準(zhǔn)確的方法之一，但它的檢測(cè)通量相對(duì)較低，而且許多較大的 EV 往往數(shù)量較少而可能無法量化。定量低于 100 nm 的低對(duì)比度 EV 的能力也可能是一個(gè)限制因素。
隨著越來越多的研究人員使用靈敏度更高的專用單顆粒分析技術(shù)，越來越清楚的是，許多 EV 制劑表現(xiàn)出不對(duì)稱的右偏分布，例如對(duì)數(shù)正態(tài)分布，其中大多數(shù) EV 直徑 <100 nm。大多數(shù)單顆粒分析技術(shù)無法解析全部的 EV 群體，因此研究者應(yīng)共享檢測(cè)到的 EV 直徑分布，而不僅僅是平均大小、集中大小或中位值大小等匯總指標(biāo)，這些指標(biāo)很容易由于 LOD 和不對(duì)稱大小分布而傾斜。請(qǐng)注意，擬合大小統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，例如通過 NTA 對(duì)低折射率顆粒進(jìn)行測(cè)量，可能更接近儀器的 LOD而不是 EV 群體的真實(shí)模態(tài)直徑。使用具有專有算法的軟件來確定粒徑的技術(shù)也可能導(dǎo)致軟件版本或軟件平臺(tái)之間的差異，因此也應(yīng)該提供軟件及其版本。從折射率假設(shè)推導(dǎo)出大小的技術(shù)可能會(huì)由于不同的樣本成分和裝載物而導(dǎo)致變化。從熒光探針（例如膜嵌入染料）推導(dǎo)的大小則可能會(huì)由于基于不同膜脂成分的不同染料嵌入而導(dǎo)致變化。對(duì)于無法區(qū)分 EV 和共分離物/污染物的技術(shù)，無論上游分離步驟如何，建議將直徑報(bào)告表述為“顆粒”或“EP”直徑，而不是“EV 直徑”。
三、EV表征技術(shù)特定報(bào)告的注意事項(xiàng)
隨著 EV 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和儀器的使用和專家知識(shí)的拓展，相關(guān)表征報(bào)告尺度的確定也在不斷增加，以確保數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性。MISEV2023指南詳細(xì)列出了最小實(shí)驗(yàn)和儀器特定報(bào)告的注意事項(xiàng)列表。無論實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如何，這些通常都適用。這里列出的技術(shù)并不詳盡，許多檢測(cè)技術(shù)正在開發(fā)或正在積極研究。然而，所列出的技術(shù)都是商業(yè)上可獲得的，并且有來自多個(gè)研究人員的發(fā)表文獻(xiàn)。（由于篇幅限制，筆者在此只列出當(dāng)前常用的幾種EV粒徑和濃度表征工具的描述及其主要觀點(diǎn)）ISEV建議，對(duì)照組應(yīng)包括作為檢測(cè)抗體的同型抗體，或同型偶聯(lián)的捕獲微珠，以及僅含有檢測(cè)抗體的捕獲微珠（用于抗體包被的捕獲珠）；應(yīng)使用多個(gè) EV上樣濃度來展示信號(hào)的滴定；如果制備微珠，應(yīng)公布其試劑和化學(xué)成分；商業(yè)捕獲微珠試劑的目錄和批號(hào)也應(yīng)公布；公布標(biāo)準(zhǔn)化微珠的中位熒光強(qiáng)度值；公布來自單態(tài)圈定微珠的等效可溶性熒光團(tuán) (MESF) 分子的數(shù)據(jù)和中位熒光強(qiáng)度值統(tǒng)計(jì)（與單 EV 流式細(xì)胞術(shù)一樣）；應(yīng)公布完整且詳細(xì)的方法學(xué)。2023年，經(jīng)由國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)（ISEV）、國(guó)際細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)步學(xué)會(huì)、國(guó)際血栓與止血學(xué)會(huì)組成的三學(xué)會(huì)工作組（EV流式細(xì)胞術(shù)工作組）倡議，出版了《單EV流式細(xì)胞術(shù)綱要》，全面解決開發(fā)單 EV 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的注意事項(xiàng)。樣本體積、熒光和光散射參數(shù)的校準(zhǔn)對(duì)于單 EV 流式結(jié)果的解釋和復(fù)制至關(guān)重要。如果使用單 EV 流式細(xì)胞儀報(bào)告顆粒濃度，請(qǐng)確定LOD的上限和下限，以允許使用正交方法或其他人來重復(fù)和驗(yàn)證該結(jié)果。目前，成像細(xì)胞儀使用動(dòng)態(tài)觸發(fā)方法，這使得較低 LOD 的確定難以定義，因此難以標(biāo)準(zhǔn)化。DLS，也稱為光子相關(guān)光譜 (PCS) 和準(zhǔn)彈性光散射 (QELS)，是一種能夠確定稀釋水溶液分散體中充分單分散顆粒的流體動(dòng)力學(xué)直徑的技術(shù)。DLS 測(cè)量溶液中多個(gè)顆粒散射的激光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)。自相關(guān)函數(shù)攜帶有關(guān)顆粒擴(kuò)散系數(shù)的信息，該信息通過斯托克斯-愛因斯坦布朗運(yùn)動(dòng)理論與流體動(dòng)力學(xué)直徑相關(guān)。可以使用多種算法從測(cè)量的自相關(guān)函數(shù)導(dǎo)出擴(kuò)散系數(shù)。最常見的方法是累積量分析，但是它假設(shè)樣本都是單分散的大小分布，而 EV 樣本是不具備這種分布的。對(duì)于 EV 樣本的多分散大小分布，擴(kuò)散的推導(dǎo)自相關(guān)函數(shù)的系數(shù)分布成為一個(gè)不適定的數(shù)學(xué)問題。這意味著 DLS 不應(yīng)用于確定 EV 樣品的定量屬性，除非 DLS 應(yīng)用于 EV 的具有單分散尺寸的某一部分。另一方面，DLS 可用于定性確認(rèn) EV 樣品中可能存在的亞微米顆粒和可能的聚集體的存在。各種電子顯微鏡 (EM) 是少數(shù)能夠檢測(cè)EV（無論大小如何）的技術(shù)之一。然而，電鏡的通量也意味著與較小的EVs相比，較大的EVs在統(tǒng)計(jì)上會(huì)被低估。SEM、TEM和Cryo-EM都是高分辨率的EV表征方法，它們也不必互相切換或能夠提供具有質(zhì)量可比的圖像。例如，Cryo-EM可以清楚地顯示脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，比TEM用于固定樣品的脫水條件更好地保持了 EV 形態(tài)，并且可能更加準(zhǔn)確定量（大小），因?yàn)橐欢w積中的所有顆粒都可以成像，而不僅僅是那些粘附在載網(wǎng)表面上的顆粒。為確定低報(bào)告要求而對(duì) EM 方法進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)化研究非常有限。對(duì)于 TEM，應(yīng)公布三個(gè)主要參數(shù)：固定、吸附和負(fù)染色方法。固定包括：使用的固定劑及其濃度和孵育時(shí)間；吸附包括載網(wǎng)材料、載網(wǎng)尺寸、薄膜類型、涂層、孵育時(shí)間和清洗細(xì)節(jié)；負(fù)染色的詳細(xì)信息應(yīng)包括底物、濃度和孵育時(shí)間。并且，應(yīng)公布低倍率和高倍率圖像以及圖像的選擇標(biāo)準(zhǔn)。NTA，也認(rèn)為是一種單顆粒跟蹤，是 EV 領(lǐng)域廣泛使用的一種光學(xué)技術(shù)，用于估計(jì)顆粒尺寸和濃度。NTA 通常采用減少直徑分布變化的算法，通過測(cè)量顆粒的擴(kuò)散系數(shù)得出流體動(dòng)力學(xué)直徑。值得注意的是，某些NTA設(shè)備上使用的 FTLA 算法是為了更好地表示單分散混合物而開發(fā)的，而 EV 則不然，這可能會(huì)導(dǎo)致人為的多種擬合分布。并且，目前沒有方法可以確定或公布 NTA 設(shè)置 的LOD。很多學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了幾項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)化研究來比較用戶和儀器之間的結(jié)果。使用 NTA 測(cè)量復(fù)雜生物流體樣本的直徑分布和濃度應(yīng)謹(jǐn)慎解釋，因?yàn)樗鼤?huì)對(duì)脂蛋白和大蛋白復(fù)合物等共分離物進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且NTA難以量化直徑在幾百納米以上的 EV。對(duì)于 NTA 的公布信息，應(yīng)包括儀器型號(hào)、相機(jī)類型、相機(jī)設(shè)置、激光波長(zhǎng)、激光功率、軟件版本、分析設(shè)置和每幀粒子。如果已知，則應(yīng)公布用于生成直徑分布的算法，因?yàn)楦鶕?jù)所使用的算法可能會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。在光散射或熒光檢測(cè)模式的情況下，建議使用空白緩沖液作為對(duì)照。對(duì)于熒光 NTA，報(bào)告光散射模式下的總顆粒數(shù)以及熒光模式下的標(biāo)記顆粒數(shù)，以及標(biāo)記去除方法和緩沖液/試劑控制從而評(píng)估標(biāo)記的偽彩情況。如果使用了流體上樣裝置也應(yīng)將其設(shè)置公布。這是MISEV第一次將電阻脈沖感應(yīng) (RPS) 技術(shù)作為與基于流式的方法（包括基于微珠的流式和單EV流式）和基于顯微鏡的方法（包括原子力顯微鏡、電鏡、DLS、NTA、超分辨顯微鏡等）并列推薦的常用EV顆粒表征方法。也是為數(shù)不多的非光學(xué)原理的EV表征技術(shù)之一。RPS利用庫(kù)爾特原理來確定顆粒的濃度和直徑，以及某些設(shè)備還具備zeta 電位功能。目前 RPS 的直徑LOD低至 ～50 nm。文獻(xiàn)報(bào)道，RPS 測(cè)量結(jié)果確實(shí)與 TEM 數(shù)據(jù)具有非常高的一致性。報(bào)告 RPS 數(shù)據(jù)時(shí)，建議公布儀器型號(hào)、孔徑、校準(zhǔn)微珠直徑和來源以及軟件版本。如之前所述（顆粒大小的定量），對(duì)于 EV 數(shù)據(jù)，推薦公布RPS的直徑分布而不是單一直徑統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。并且建議納入空白緩沖液的對(duì)照來識(shí)別背景，以及相同濃度的去污劑裂解后的樣品以確定標(biāo)記事件。由于 RPS 技術(shù)很容易被較大顆粒堵塞，因此可以使用離心或過濾等分析前步驟來去除較大顆粒。由于這些方法可能會(huì)改變正在分析的 EV 群體并影響與正交方法的比較，因此應(yīng)明確說明任何分析前處理程序。需提供蛋白質(zhì)富集和定量的詳細(xì)信息；如果可能，需包括抗原的陽性和陰性對(duì)照 ；如果聲稱蛋白質(zhì)與 EV 相關(guān)，需要包括 EV 制劑的純度測(cè)量。報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)化上樣、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜方法、探針和成像/分析的所有詳細(xì)信息（包括但不限于抗體信息、樣品變性和還原條件、轉(zhuǎn)膜方法、膜類型、緩沖液以及成像設(shè)備和參數(shù)）；提供所有WB的未裁剪圖像（如果在期刊上發(fā)表，則需要作為補(bǔ)充信息）。該指南在以上各章節(jié)中，分別討論了 EV 表征的不同方法，并提供了具體建議。無論采用何種方法，表征的總體建議總結(jié)如下：- 每種 EV 制劑應(yīng)通過 EV 來源的定量測(cè)量來定義（例如，分泌細(xì)胞的數(shù)量、生物流體的體積、組織的質(zhì)量等）。
- 應(yīng)估算 EV 的豐度（包括顆粒數(shù)量、蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)含量）。
- 應(yīng)檢測(cè) EV 制劑是否存在與 EV 亞型或EV 相關(guān)的成分，具體取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康乃璧奶禺愋浴?/span>
- 當(dāng)使用定量指標(biāo)表征 EV 時(shí)，需提供儀器或方法的檢測(cè)限 (LOD) 。
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