CHO細胞包括從CHO-ori細胞系衍生出CHO-DXB11 (DHFR+/-) 、CHO-DG44 (-/-) 、CHO-GS、CHO-K1SV等多種細胞系，各具特定的特征，可分離穩(wěn)定的轉染物并獲得高產量。與其他重組蛋白質生產細胞系相比，CHO細胞具有更高的生產力，流加批次培養(yǎng)可達到1-10 g/L。而相較于293細胞，病毒不易感染CHO細胞并在其中復制。CHO細胞對于蛋白的翻譯后加工修飾與人類細胞的高度相似，如糖基化、二硫鍵形成以及蛋白的水解加工，但是也與人類細胞在翻譯后修飾的特定模式與結構上存在微妙差異，沒有工程化修飾過的CHO細胞不能合成某些人源聚糖鍵，比如：α-2,6-唾液酸化、二分N聚糖和α-1,3/4-巖藻糖基化，為了在CHO細胞內實現目的蛋白的糖基化，不同的團隊也開發(fā)了相應的糖工程方法。CHO細胞可以進行高密度無血清懸浮培養(yǎng)，并將目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，因而是一個經濟有效的大規(guī)模重組蛋白表達平臺。

CHO細胞中重組蛋白的表達可受到多種因素影響，包括：表達質粒、啟動子的選擇、培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基成分、溫度、溶氧）、CHO細胞系的選擇和表達系統(tǒng)的選擇等。利用CHO細胞進行重組蛋白表達包括瞬時表達和穩(wěn)定表達兩種方式。瞬時表達系統(tǒng)中含有目的基因的cDNA會隨著細胞分裂而被稀釋，表達周期較短。盡管瞬時表達的效率低于穩(wěn)定表達，但優(yōu)化策略后的蛋白產量也可高達1 g/L。而瞬時表達減少了與細胞系開發(fā)相關的時間和成本，被廣泛用于臨床前研究中蛋白的快速生產。CHO細胞穩(wěn)轉則是大規(guī)模生物制造的標準方法。

蛋白亞單位疫苗是基于病原體的一種或幾種分離或選定的成分，通常是免疫顯性抗原（全蛋白、蛋白結構域或多肽），可在佐劑刺激下使產生體液和/或細胞免疫。蛋白亞單位疫苗因為沒有恢復到致病形式的風險，也被認為比滅活疫苗或減毒活疫苗更安全。

蛋白亞單位疫苗已被批準用于多種病毒感染性疾病的預防，如：SARS-CoV-2、水痘-帶狀皰疹病毒、呼吸道合胞病毒和流感，劑量范圍從5到180 ug。盡管新冠的蛋白亞單位疫苗應用范圍沒有其他類型疫苗廣，但仍是目前臨床前和臨床候選疫苗的主要選擇。蛋白亞單位疫苗的一個潛在挑戰(zhàn)是免疫原性較低，這也凸顯了識別抗原以引起強大保護性免疫的重要性。

呼吸道合胞病毒是呼吸道感染的主要原因，在幼兒、老年人和慢性病患者中可引起嚴重疾病，2019年幼兒死亡人數超過100000人，在高收入國家中造成2.2萬到4.7萬人死亡。早期使用甲醛滅活的RSV疫苗，甲醛導致病毒抗原產生羰基集團，阻礙了抗原在細胞質中的加工，產生了低親和力的抗體，從而導致了增強型的RSV疾病，表現為：高燒、支氣管炎和呼吸困難。目前RSV表面的病毒融合 (F) 蛋白作為疫苗開發(fā)的潛在靶點，這種預融合穩(wěn)定形式的設計已被證明可以產生有效的中和抗體。但也有研究表明，即使采用低劑量預融合F蛋白在動物上也可能產生增強型RSV疾病。

相比之下，預融合的F蛋白在成人接種時表現出較好的結果，也導致葛蘭素史克開發(fā)的RSV疫苗Arexvy疫苗 (RSVPreF3 OA) 的獲批上市。該疫苗使用CHO細胞生產，由F蛋白的1-513號殘基組成，通過T4纖維蛋白結構單元三聚體化。預融合形式通過將F1的Ser155和Ser290替換為半胱氨酸而實現，在不穩(wěn)定的N端和結構剛性中心區(qū)域之間建立了二硫鍵，另外引入S190F和V207L突變以填充F1N端空隙，增加疏水相互作用。在早期臨床試驗展現良好的安全性，并確認其誘導產生中和抗體的能力后，和AS01E佐劑一起進入了III期臨床，在17個國家25000名60歲以上成年人中評估有效性。研究結果顯示，單劑該疫苗對RSV相關的下呼吸道疾病的有效性為82.6%，對嚴重表現的有效性為94.1%，對RSV相關急性呼吸道感染的有效性為71.7%。

第二個獲批的RSV疫苗是輝瑞公司的Abrysvo，是由CHO細胞生產的針對RSV A和B亞群的雙價融合前F蛋白。在III期臨床中，對RSV相關的下呼吸道疾病有66.7%的有效性，對嚴重RSV相關疾病有85.7%的有效性，且嚴重不良事件發(fā)生率低，安全性無明顯問題。并且也作為孕婦疫苗進行評估，接種孕婦時間為妊娠第24-36周，該疫苗顯示在新生兒出生后的前90天內，預防嚴重RSV相關呼吸道疾病有81.8%的有效性，因此獲批做為預防嬰兒RSV的母親疫苗。

以上兩個疫苗受到了市場的廣泛接受，在三個月內達到了12.35億美元的銷售額，也凸顯了CHO細胞在疫苗制備中的商業(yè)潛力。

VZV可引起水痘，是一種與典型皮疹和輕微癥狀相關的高度傳染性感染。初次感染后，病毒可在神經元中持續(xù)存在，多年后重新激活會引起帶狀皰疹；重新激活后以皮疼痛性水皰性皮疹為特征，在免疫受損的宿主中可能導致出血性病變，最主要的并發(fā)癥為急性神經炎和帶狀皰疹后神經痛，影響50歲以上的25%-50%的患者。

為了保護年長或免疫缺陷的成年人，重組VZV疫苗Shingrix于2017年由FDA獲批，一年后獲批EMA。Shringrix是以VZV病毒表面普遍的gE蛋白為抗原，是中和抗體和T細胞識別的關鍵靶標。該疫苗由CHO細胞生產，并由于去除了C端和跨膜結構域而可以被分泌到細胞外。在抗原產生過程中，CHO細胞的培養(yǎng)條件優(yōu)化后，使用20 L的波浪式反應器進行批培養(yǎng)，最終每升產量在2.44 g。在50歲以上人群中，有效性達97.2%以上。

HCMV是一種感染了約80%人口的病原體，一旦個體免疫降低就會引發(fā)健康風險。并且也與各種癌癥進展有關，其先天性感染也是出生缺陷的主要原因。即便如此，目前也沒有批準上市的疫苗。但有幾款疫苗在臨床試驗中，其中有幾款疫苗基于HCMV表面的gB蛋白由CHO細胞產生，與病毒入侵過程中的膜融合至關重要，并且包含中和抗體的多個識別表位，該蛋白與佐劑MF59正處于臨床II期進行測試。賽諾菲的gB基因來源于HCMV Towne毒株，不含跨膜結構域和弗林切割位點。gB/MF59疫苗在移植后患者、產后婦女和健康的青春期女孩等不同受眾中均獲得了良好的效果，結果顯示，gB結合抗體滴度增加，CD4+T細胞反應增強，HCMV病毒血癥降低。

葛蘭素史克的另一款gB蛋白亞單位疫苗處于臨床I期試驗中，抗原基于AD169毒株，其修飾與賽諾菲相似。另外，來自單純皰疹病毒1型的gD氨基酸序列融合在AD169 gB序列以促進分泌。

最近葛蘭素史克開發(fā)的針對HCMV的新型佐劑，由gB蛋白和五聚體抗原組成。HCMV五聚體復合物也是疫苗開發(fā)中的具有吸引力的抗原，相比于gB蛋白，能誘導更有效的抗體中和進入上皮細胞。因此，葛蘭素史克使用CHO-K1和CHO-DXB11衍生的細胞克隆獲得400 mg/L的五聚體復合物，并在小鼠中誘導了有效的中和免疫反應。五聚體/gB 蛋白亞單位疫苗候選藥物目前正在健康成人受試者中進行評估。

即使在發(fā)現HIV病毒40年后，HIV功能性疫苗的挑戰(zhàn)仍然存在，主要原因包括逆轉錄酶中缺乏3’核酸外切酶的校對活性，使得病毒gp41和gp120可快速突變。而中和抗體靶向的抗原表位位于HIV包膜蛋白的gp可變區(qū)域，在免疫系統(tǒng)的篩選壓力下也會導致突變體的產生。

HIV env gp重組三聚體是目前作為疫苗開發(fā)潛力的靶點，可能會引發(fā)廣泛的中和抗體。始終保持融合前構象的早期可溶性三聚體稱為“SOSIP”，其中包括gp120-gp41之間的工程化二硫鍵 (SOS) 以及有助于維持融合前構象的螺旋斷裂突變（I559P，稱為IP）。最近的臨床試驗中的SOSIP三聚體已經進行了改進，包括CHO細胞的改進。其中某些env蛋白，尤其是HIV分支B的env蛋白容易受蛋白水解影響。為了解決這個問題，采用了工程化的C1蛋白酶缺陷的CHO細胞系，從而減少蛋白降解。三聚體4571 (BG505 DS-SOSIP.664) 是基于HIV A分支的高度穩(wěn)定的與融合閉合可溶性包膜糖蛋白三聚體。該三聚體在gp120中結合了201C-433C二硫鍵突變以防止CD4誘導的構象變化。最近三聚體4571在I期臨床試驗中進行了獨立評估，并在異源方案中作為加強劑量中做了評估，結果顯示三聚體4571是安全的，沒有引起不良反應，并能夠成功誘導特異性抗體產生，主要是集中在三聚體上的無聚糖基底上的抗體。但是對于天然三聚體，通常由于免疫系統(tǒng)無法接觸到無聚糖基底而導致其在臨床試驗中具有更明顯的非中和反應。為了減少這種基底定向免疫，未來CHO細胞生產的蛋白亞基疫苗可以使用聚糖進行工程設計以掩蓋三聚體基底結構域，減少非中和抗體的產生。

SARS-CoV-2蛋白亞單位疫苗開發(fā)廣泛使用的策略之一是使用S蛋白的胞外結構域 (ECD) 作為抗原。Medigen Vaccine Biologics Corporation開發(fā)的MVC-COV1901疫苗基于融合前穩(wěn)定的S ECD三聚體，該三聚體具有K986P和V987P突變，以及在S1/S2連接處具有弗林蛋白酶切割位點682突變 (RRAR>GGAS) ，以提高穩(wěn)定性并增加了T4纖維蛋白三聚體化結構域。CHO細胞用于生成表達該S抗原的穩(wěn)定克隆，該抗原被證明類似于人HEK293細胞表達的SARS-CoV-2 S蛋白的結構。該候選疫苗用氫氧化鋁（明礬）和CpG 1018佐劑，CpG 1018是一種TLR-9激動劑，通過刺激CD4+/CD8+T淋巴細胞來增強免疫原性。II期臨床試驗 (NCT04695652) 表明，MVC-COV1901是安全的且耐受性良好，并且在年輕人和老年人中都能誘導高中和抗體滴度。MVC-COV1901還與牛津-阿斯利康的ChAdOx1 nCoV-19病毒載體疫苗進行了比較，其中MVC-COV1901被證明，可誘導更廣泛的IgG亞類和更高的抗Omicron (BA.1) 變體的中和抗體滴度。MVC-COV1901已獲準在斯威士蘭、巴拉圭、索馬里蘭和中國臺灣使用。

SARS-CoV-2 S蛋白內的受體結合域 (RBD) 是中和抗體的主要靶點。因此，它已被用于生產各種蛋白亞單位疫苗。已經探索了不同的策略來進一步增強其抗原性，例如使用單體、二聚體或多聚體形式。

ZIFIVAX (ZF2001) 疫苗由安徽智飛龍康生物制藥公司開發(fā)，由三劑基于RBD的疫苗和明礬佐劑組成。ZF2001是由兩個拷貝的RBD (R319-K537) 形成并在CHO細胞中產生串聯(lián)重復的二聚體。這種RBD二聚體與RBD單體保持相似的親和力，而且能夠有效地與人ACE2受體結合。在I期和II期臨床試驗中，ZF2001在人體中表現出安全特征和免疫原性。在多個國家/地區(qū)進行的III期臨床試驗顯示，在接種疫苗后至少六個月內對有癥狀和重度至危重，ZF2001疫苗已獲準在中國、哥倫比亞、印度尼西亞和烏茲別克斯坦使用。

CHO cells for virus-like particle and subunit vaccine manufacturing