簡介

手性分子是一種有機(jī)化合物，它具有一種特殊的性質(zhì)，即互為不可重疊的鏡像。這意味著它們以兩種形式存在，稱為對映體，除了原子的三維排列外，它們在各方面都是相同的。雖然這些對映體具有相同的化學(xué)性質(zhì)，但它們可能具有不同的生物活性和藥理作用[1,2]。因此，手性分子在制藥工業(yè)中變得越來越重要，它們被用于開發(fā)藥物和其他治療方法，因此分離對映體十分重要。

超臨界流體色譜法(SFC)在手性分子的分離純化中，具有其他分離技術(shù)不可比的優(yōu)點(diǎn)。SFC 使用超臨界二氧化碳作為流動(dòng)相，這是一種清潔和綠色的溶劑，很容易從最終產(chǎn)品中去除。此外，SFC 提供了高分辨率和快速的分離。

預(yù)測哪種固定相能夠有效分離 SFC 中特定的一組對映異構(gòu)體，即使在現(xiàn)在看來也是十分困難，這使得我們需要選擇合適的手性固定相來不斷試錯(cuò)[2]。

手性 SFC 多采用與手性高效液相色譜(HPLC)相同的色譜柱，其中常用的是多糖手性固定相(CSPs)，由于可以選擇不同改性的多糖，因此具有很強(qiáng)的通用性[3]。多糖 CSPs 具有高負(fù)載能力，這使得它們在制備規(guī)模應(yīng)用中非常有用。許多商業(yè)多糖手性固定相是可用的，主要是基于直鏈淀粉或纖維素和改性的鹵化或非鹵化芳香基團(tuán)。改性后的多糖可以包被或固定在二氧化硅載體上，以增強(qiáng)其對強(qiáng)溶劑的抵抗力[3]。還有其他 CSPs 通常用于手性 SFC 應(yīng)用，例如，Pirkle 型手性固定相[3]。

本文介紹了使用 Sepmatix 8x SFC 對反式二苯乙烯氧化物(TSO)進(jìn)行平行柱篩選，隨后通過方法優(yōu)化轉(zhuǎn)移到制備的 Sepiatec SFC-50。

設(shè)備

• Sepiatec SFC-50

• Sepmatix 8x SFC

• PrepPure cCDMPC, 5um, 250 x 4.6mm

• PrepPure cADMPC, 5um, 250 x 4.6mm

• PrepPure iADMPC, 5um, 250 x 4.6mm

• PrepPure iCDMPC, 5um, 250 x 4.6mm

• PrepPure iCDCPC, 5um, 250 x 4.6mm

• PrepPure iBT, 8um, 250 x 4.6mm

• PrepPure iBT, 8um, 250 x 10mm

試劑和耗材

• 二氧化碳(99.9%)

• 甲醇(≥99%)

• 乙醇(99%)

• 異丙醇(99%)

• 乙腈(99%)

• 反式二苯乙烯氧化物(99%)

（為了安全操作，請注意所有相應(yīng)的MSDS）

實(shí)驗(yàn)過程

樣品制備：

在篩選和方法優(yōu)化時(shí)，將 0.075g 反式二苯乙烯氧化物溶解在 5.0mL 甲醇中；在堆疊注射時(shí)，將 0.1909g 反式二苯乙烯氧化物溶解于 6.0mL 甲醇中。

使用 Sepmatix 8x SFC 進(jìn)行篩選：

篩選是全自動(dòng)運(yùn)行，采用流量控制單元，將每通道內(nèi)的流量設(shè)置為 3mL/min，并將流量平衡。樣品自動(dòng)進(jìn)樣（每根色譜柱 5μL），啟動(dòng)平行篩選（運(yùn)行時(shí)長=10分鐘）。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150bar，柱溫箱設(shè)置為32℃。

使用 Sepiatec SFC-50 進(jìn)行制備：

PrepPure iBT 色譜柱在設(shè)定的流速下預(yù)熱 4 分鐘，樣品通過定量環(huán)自動(dòng)進(jìn)樣并運(yùn)行。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150bar，柱溫箱設(shè)置為 40℃。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

色譜柱篩選：

為了確定手性化合物 TSO 的最佳分離條件，進(jìn)行了不同手性色譜柱的篩選，使用 Sepmatix 8x SFC 允許同時(shí)進(jìn)行 8 根不同色譜柱的平行篩選。本實(shí)驗(yàn)一共使用了 6 根不同色譜柱：Chiral iADMPC, Chiral iCDMPC, Chiral iCDCPC, Chiral iBT, Chiral cADMPC 和 Chiral cCDMPC。圖1 為色譜柱篩選結(jié)果，其中 Chiral iADMPC 色譜柱不能很好地分離對應(yīng)異構(gòu)體 TSO（可見表1），而 Chiral iCDMPC，Chiral iCDCPC，Chiral iBT，Chiral cADMPC 和 Chiral cCDMPC 色譜柱可以分離 TSO。

在處理復(fù)雜的混合物時(shí)，分辨率 R 是一個(gè)特別重要的參數(shù)，因?yàn)樗饬苛嗣恳淮畏蛛x的程度，并且可以被準(zhǔn)確識別和量化。例如分辨率 R=1 表明了不理想的分離效果，兩個(gè)峰本質(zhì)上并沒有分離，更高的分辨率數(shù)值代表了更好的分離效果。在實(shí)際運(yùn)行過程中，分辨率 R 至少達(dá)到 1.5 才會被認(rèn)為是分離的。表1 顯示了不同色譜柱分離 TSO 時(shí)的分辨率 R。在轉(zhuǎn)移至 SFC-50 制備時(shí)，選擇 iBT 色譜柱，因?yàn)樗凶罴训姆蛛x效果，最容易實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，進(jìn)樣量可大大提高。

表1. 使用 Sepmatix 8x SFC 篩選時(shí)不同色譜柱的分辨率

使用 SFC-50 進(jìn)行結(jié)果優(yōu)化

為了確定改性劑對 TSO 的影響，下列每一種改性劑都在等度條件下使用：PrepPure iBT, 8um, 250 x 10mm 色譜柱；甲醇，乙醇，異丙醇，乙腈 (見圖2)。

甲醇(偶極矩參數(shù)= 5[4])在對映體有足夠的峰距的情況下，僅在 3 分鐘內(nèi)分離 TSO。乙醇(偶極矩參數(shù)= 4[4])作為極性稍小的改性劑，分離所需時(shí)間略大于 3 min。異丙醇(偶極矩參數(shù)= 2.5[4])在不到 3.5 分鐘的時(shí)間內(nèi)分離 TSO，這是由于異丙醇的極性較小。乙腈(偶極矩參數(shù)= 8[4])在 2.25 分鐘內(nèi)有效地分離 TSO。然而，甲醇被用作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的改性劑，因?yàn)樗恼鍖捄蛯ΨQ峰有望帶來高進(jìn)樣量。此外，它比乙腈毒性更小，價(jià)格也更便宜。

由于流動(dòng)相中改性劑的含量會因極性變化而對分離產(chǎn)生影響，所以采用了不同的甲醇含量(見圖3)。

流動(dòng)相甲醇含量由 20% 連續(xù)增加到 35%，運(yùn)行時(shí)間逐漸縮短。當(dāng)改性劑含量為 35% 時(shí)，運(yùn)行時(shí)間可以從大約 3.5 分鐘縮短至約 2.5 分鐘。不過分辨率有所降低，對映體的峰寬也降低了。因此，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，改性劑的濃度被設(shè)定為 35%。

每根色譜柱都有可達(dá)到最大效率或理論塔板數(shù)的固有最佳流速。如果流量減小或增大，則用非最佳分離塔板數(shù)進(jìn)行分離。與液相色譜法相比，SFC 可以使用更高的流速，而分離塔板數(shù)不會大幅減少[5]。因此，圖4顯示了流速對分離效率的影響。

隨著流量的增加，運(yùn)行時(shí)間和峰寬進(jìn)一步減小。運(yùn)行時(shí)間從大約 2.5 分鐘縮短至 2 分鐘以內(nèi)。根據(jù)樣品的不同，溫度和壓力對組分的分離和保留的選擇性有影響。因此，在 100 bar 和 150 bar 以及 40℃ 和 50℃ 范圍內(nèi)進(jìn)行了 4 次實(shí)驗(yàn)（見圖5）。可以看出，溫度和壓力的變化對各自的分離沒有明顯的影響。因此，疊層進(jìn)樣時(shí)，溫度控制在 40℃，背壓調(diào)節(jié)器控制在 150 bar。

為了提高分離效率，增加 TSO 的濃度和進(jìn)樣量(150μL ~ 250 μL)（見圖6左上）。在這些條件下，基線分離仍然是可行的。圖6（右上和下）顯示了在與單次進(jìn)樣圖 6 左上相同的實(shí)驗(yàn)條件下，疊層進(jìn)樣時(shí)間為 0.97min，即每 0.97 分鐘進(jìn)樣一次。在這種情況下，每次額外注入都節(jié)省了平衡時(shí)間，提高了產(chǎn)能。最終采用基于時(shí)間的方法收集餾分。每次進(jìn)樣的紫外信號都表明了該方法具有良好的再現(xiàn)性（圖6右上）。垂直線表示收集相應(yīng)餾分的時(shí)間窗口。

結(jié)論

在文中，使用 Sepmatix 8x SFC 儀器進(jìn)行以 TSO 為分析物的手性柱篩選，將最合適的手性色譜柱，轉(zhuǎn)移到 Sepiatec SFC-50 儀器進(jìn)行制備。每根手性柱對手性物質(zhì)的反應(yīng)都不同，這就是為什么在純化過程之前必須進(jìn)行篩選的原因，作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的 TSO 可以在許多不同的手性柱上分離。

隨后在 SFC-50 上放大，并利用制備柱對等度純化的方法進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，改性劑的選擇、改性劑在流動(dòng)相中的比例和流量對分離效果有較大影響。在這些特定條件下，溫度和壓力的變化對分離效果的影響不大。在一般情況下，這兩個(gè)參數(shù)也可以改變以優(yōu)化分離條件。

參考文獻(xiàn)

1. doi.org/10.1038/s41570-023-00476-z

2. SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY, Terry A. Berger, Agilent Technologies, Inc., 2015

3. PRACTICAL APPLICATION OF SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY FOR PHARMACEUTICAL RESEARCH AND DEVELOPMENT, Vol. 14, M. Hicks and P. Ferguson, 2022 Elsevier Inc.

4. Laboratory Chromatography Guide, ISBN 3-033-00339-7, by Büchi Labortechnik AG (Switzerland)

5. dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2012.10.005