凍干法通常是優先選擇的樣品干燥方法，因為它能在低殘留溶劑水平的情況下實現高水平的干燥。此外，樣品的輕質、粉狀、"蓬松"的表面處理使樣品易于取出和稱量。然而，凍干法也存在許多局限性。

在本文介紹的這項研究中，我們將展示Genevac如何通過將工藝轉移到溶劑蒸發工作站中來改變優化方法，并實現純化實驗室想要的結果。

研究介紹

多年來，凍干或冷凍干燥一直用于在實驗室中干燥樣品。該技術經過深入研究，已成為許多需要干燥少量樣品的研究人員的優先選擇方法。

然而，傳統的冷凍干燥設備存在許多潛在的缺點，包括：

● 須在有限范圍的溶劑中制備樣品，通常只能使用水；

● 不能使用揮發性有機溶劑及其混合物；

● 干燥周期過長，能耗成本高。

通常，有許多樣本和多種溶劑處理的研究人員（比如來自含有水和乙腈的制備性反相高效液相色譜分離），已經開始使用離心濃縮儀。而在其他實驗室中，例如，有機溶劑的侵蝕性使得凍干機不適用，這時普通的離心濃縮將存在很大的局限性。

純化問題

純化實驗室接收到含有水和已腈的樣品，通常會含有0.1%TFA的改性劑。采用凍干法去除這些溶劑存在著以下幾個困難：

● 乙腈需要非常低的真空來凍結它，或者需要一個能夠主動凍結樣品的凍干機。乙腈在-65°C時凍結。如果它沒有被凍結，那么很可能會發生暴沸，這將導致樣品損失和交叉污染；

● 其次，冷凝器中的乙腈會破壞真空，后續幾乎不可能對水進行冷凍干燥；

● 這種緩慢的凍干過程與生產希望縮短的工藝時間不兼容。而Genevac溶劑蒸發工作站可以快速并行地干燥許多不同的樣品，而不會發生暴沸。

另外，用戶報告說明在一批樣品中干燥時遇到了一些困難。例如，TFA的殘留問題；存儲時損壞樣品的問題；并且該化合物可能會與水發生相互作用使得化合物的沸點提高。殘留溶劑會在核磁共振分析中顯示出來。雖然以上問題偶爾會發生，但手動挑選一些處理不全的樣品，對于自動化實驗室來說是不可接受的；因此整個批次樣品都需要重新處理。

新工藝：在離心蒸發器中凍干

在水中制備的樣品可以在離心蒸發器中通過抽取最佳可用真空進行凍干，在配備耐溶劑渦旋泵的極限真空低于0.5mbar；足以凍結水。這就像冷凍干燥一樣緩慢。

Genevac開發了一種新工藝，用戶可以利用離心蒸發器的速度蒸發一些溶劑，然后在只剩下幾毫升溶劑時切換到凍干模式。處理96x30ml級分所需的處理時間從冷凍干燥機中的48小時到Genevac HT-12中的16小時（過夜），相當于每個30ml樣品順序處理僅需10分鐘。

圖1：Genevac HT-12溶劑蒸發工作站

水和乙腈的凍干

我們將0.01M布洛芬鈉鹽的水溶液儲備液用作標準樣品。將15ml溶液裝入48個20ml樣品瓶中，并在各種條件下置于 Genevac HT-12蒸發器中進行干燥。

圖2：Genevac 20ml小瓶轉子

實際的蒸發方法通常包括多達四個階段：

1. 使用快速蒸發濃縮大部分溶劑；

2. 冷卻樣品和樣品架，準備；

3. 使用深真空冷凍樣品；

4. 凍干殘留溶劑，加熱或不加熱；

以上的步驟關鍵在于如何把水凍住和干燥。

我們重點關注如何把已腈全去除考慮了進去，這個階段將分為三個步驟，以在濃縮水之前去除乙腈：

1. Dri-Pure®—真空斜坡和高轉子速度防止爆沸；

2. 濃縮—在40mbar 的真空度下去除乙腈而不凍結水（此處乙腈在+2°C沸騰）；

3. 排空冷凝器—因為殘留的乙腈會破壞后期階段的真空。

不同干燥方式的最終樣品形態對比

我們在60:40的水和乙腈混合物中制備0.01M布洛芬鈉鹽溶液。試驗表明不需要冷卻階段。通過調整以實現濃縮和凍干的正確平衡。48x15ml樣品在5小時內干燥，相當于連續干燥6.25分鐘。下圖顯示了凍干結果與傳統離心蒸發樣品之間的差異。差異很明顯，凍干樣品的再溶解更容易，而干燥的樣品不容易全部溶解。

A –過度干燥= 傳統蒸發結果

B—凍干結果

結論

樣品的凍干提高了干燥后樣品的溶解度。在凍干階段加入熱量大大減少了凍干時間。當凍干水和乙腈混合餾分時，Genevac HT系統集成了自動除霜和排水功能，提高了整個流程的自動化程度，無需人為干預。

應用案例一：榮譽制藥

從難以干燥的HPLC純化餾分中制備可稱量樣品

通常在純化后，樣品都會被干燥，然后用少量的溶劑重新溶解后分到一個（小）樣品容器中存儲。通常這些會被用作分析方法，如干重測定產量和NMR分析的子抽樣。KuDOS制藥公司的科學家遇到了在純化后樣品干燥困難的問題。對于KuDOS，典型的頑固樣品會形成膠狀物或油狀物，從而造成處理問題，包括：

● 未完-全干燥的樣品導致無法確定真實重量；

● 殘留溶劑促進更快的化合物降解。

解決方案

KuDOS/阿斯利康聯合開發了一種新的樣品干燥方法，它克服了殘留溶劑和餾分匯集的問題。

處理和合并流程

1. 將干燥的部分重新溶解在最少的水和甲醇中；

2. 將級分匯集到20ml閃爍瓶中并干燥；

3. 樣品溶解在極少量的 1,4-二惡烷中：一些頑固的樣品以樹膠或油的形式存在；

4. 將餾分匯集到帶有條形碼的去皮小瓶中；

5. 小瓶放置在樣品架中用于蒸發，并冷凍在–20°C的冰箱中；

6. 使用Genevac HT-12蒸發器在完-全真空下凍干小瓶，通常過夜。

結果適用于>90%  以前難以處理的樣品，可以得到易碎的“蓬松”固體，可以輕松處理并完-全干燥。對于少數在1,4-二氧六環中溶解不好的樣品，已經成功使用了兩種方法：

1. 將樣品重新溶解在少量甲醇（2-3ml）中，然后加入水（約10ml），樣品在Genevac HT中使用真空梯度干燥（Dri-Pure ) 以防止碰撞加上完-全真空以凍結水；

2. 將樣品重新溶解在少量叔丁醇中（在+25°C下冷凍，非常適合凍干），然后在全真空下干燥。

結果：“蓬松”固體或結晶樣品（干燥且可稱重）

應用案例二：諾華生物醫學研究所

在凍干過程中保護樣品免受交叉污染的簡單方法

NIBMR報告生產了完-全凍干的“蓬松”樣品，沒有殘留溶劑，也沒有交叉污染。

方法

選擇以下氨基酸 L-Asn、L-Asp、L-Arg和一種大環內酯xy作為凍干試驗的模型化合物。根據對樣品溶解度的研究知識，為樣品開發和選擇了以下范圍的溶劑混合物和體積：

● 1,4-二惡烷 – 2-3ml

● 叔丁醇 – 2-3ml

● 水 – 1-1.5ml

● 1,4-二惡烷和水 (1:1) – 約2ml

● 叔丁醇和水 (1:1) – 約2ml

使用1.0ml注射器測量溶劑體積。須使用足夠的溶劑才能實現良好的冷凍——樣品僅使用真空冷凍。樣品體積在真空下減半，樣品在二十分鐘后完-全冷凍。

將樣品凍干在4ml小瓶中，小瓶固定在微孔板支架上，使樣品免受過多熱量的影響。

在有和沒有加熱階段的情況下進行試驗。兩種設置都產生了凍干樣品，但偶爾會看到一些粉末從試管中飄出并進入蒸發室。

防止交叉污染

通過限制通風口并用穿孔的石蠟膜覆蓋樣品，避免了可能被吹散的蓬松樣品的交叉污染。使用質子NMR對樣品進行了測試，發現沒有殘留溶劑和交叉污染。取下薄膜時需要小心。交叉污染也可以通過應用更高的g力來消除。

結論

仔細的樣品制備過程、高向心力的應用和高真空生產的產品沒有交叉污染。

關于作者

KuDOS 案例作者：

1. Adrian Moore 是英國霍舍姆 KuDOS Pharmaceuticals 的分析小組組長；

2. Mandy Crowther 是英國奧爾德利公園阿斯利康公司的Deputy Chief Scientist；

3. Rob Darrington 是英國伊普斯維奇 Genevac Ltd 的產品經理。

諾華案例作者：

1. Klemens  Hoegenauer 博士是奧地利維也納諾華生物醫學研究所的高級研究員；

2. Induka Abeysena 博士是英國伊普斯威奇 Genevac Ltd的應用化學家。

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Genevac

英國Genevac是德祥集團資深合作伙伴之一。英國Genevac公司成立于1990年，隸屬SP Scientific旗下，一直專注于研究和生產各種離心蒸發濃縮設備，其產品廣泛應用于生命科學、制藥、化學、分析等領域。

德祥科技

德祥科技有限公司成立于1992年，總部位于中國香港特別行政區，分別在越南、廣州、上海、北京設立分公司。主要服務于大中華區和亞太地區——在亞太地區有27個辦事處和銷售網點，5個維修中心和2個樣機實驗室。

30多年來，德祥一直深耕于科學儀器行業，主營產品有實驗室分析儀器、工業檢測儀器及過程控制設備，致力于為新老客戶提供更完善的解決方案。公司業務包含儀器代理，維修售后，實驗室咨詢與規劃，CRO凍干工藝開發服務以及自主產品研發、生產、銷售、售后。與高校、科研院所、政府機構、檢驗機構及諸多企業保持密切合作，服務客戶覆蓋制藥、醫療、商業實驗室、工業、環保、石化、食品飲料和電子等各個行業及領域。

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