EPR

利用布魯克的定量軟件包，

進(jìn)行自由基和過(guò)渡金屬的鑒定和定量

秉持誠(chéng)信 不斷創(chuàng)新

摘要

在科學(xué)研究和過(guò)程/質(zhì)量控制中利用分析技術(shù)鑒定和定量特定物種，是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。電子順磁共振（EPR）波譜就是這樣一項(xiàng) 技術(shù)，它適用于鑒定和定量液體或固體樣品中的自由基和過(guò)渡金屬離子。憑借獲由SpinCount和SpinFit模塊組成 的定量軟件包，布魯克讓EPR技術(shù)變得更易用、更便捷。該定量軟件包對(duì)于所有采用Xenon和Xepr軟件的布魯克EPR波譜儀 是標(biāo)配，對(duì)于采用ESRStudio軟件的Magnettech ESR5000波譜儀是可選項(xiàng)。該定量軟件包可直接實(shí)現(xiàn)樣品的精準(zhǔn)定量，而 無(wú)需與標(biāo)準(zhǔn)樣品或單獨(dú)測(cè)得的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。由此布魯克可為眾多不同的科學(xué)研究或過(guò)程/質(zhì)量控制提供一種可靠易 用的解決方案。

引言

利用波譜技術(shù)對(duì)樣品中的特定物種進(jìn)行定性或定量，是進(jìn)行科學(xué)研究和過(guò)程/質(zhì)量控制的基礎(chǔ)。電子順磁共振（EPR）波譜 讓研究人員能夠鑒定和定量樣品中的自由基和過(guò)渡金屬離子。和大多數(shù)光譜技術(shù)不同的是，EPR對(duì)樣品不透明度或濁度沒(méi) 有限制，且定量信息不依賴于消光系數(shù)的精度。通過(guò)EPR鑒定順磁性物質(zhì)只取決于物種本身的性質(zhì)。與核磁共振（NMR）波 譜等其他磁共振技術(shù)不同的是，EPR不受分子量的限制。只需對(duì)來(lái)自目標(biāo)自由基或過(guò)渡金屬離子的EPR信號(hào)進(jìn)行二重積分，  即可獲得定量信息，可以免于來(lái)自非順磁性物質(zhì)的干擾。然而，即使是用EPR來(lái)鑒定物種也依賴于知識(shí)儲(chǔ)備，且定量時(shí)通常 需要花費(fèi)大量時(shí)間去構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

為了解決所有光譜技術(shù)存在的共同局限及EPR存在的挑戰(zhàn)，布魯克打造出了榮獲SpinFit和SpinCount軟件包。該軟 件包能夠無(wú)需參比物直接定量和明確鑒定不同樣品中的順磁性物質(zhì)。SpinCount讓研究人員能夠從原始數(shù)據(jù)中獲取定量信 息，而無(wú)需與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較，亦無(wú)需用到校準(zhǔn)曲線。SpinFit模塊及其中所含的常見(jiàn)自由基和過(guò)渡金屬離子的譜圖庫(kù)， 讓研究人員即使只具備很少的知識(shí)儲(chǔ)備也能鑒定出物種。取決于所用軟件，EPR波譜儀最多可配置來(lái)自SpinFit家族的三個(gè) 成員： Isotropic SpinFit、SpinFit Liquids和Aniso SpinFit。SpinFit通過(guò)將原始數(shù)據(jù)與一個(gè)小參數(shù)集進(jìn)行擬合來(lái)輕松實(shí)現(xiàn)物 種鑒定，而用戶只需輸入很少的信息。Isotropic SpinFit和SpinFit Liquids是用于模擬和擬合溶液中的自由基和過(guò)渡金屬的 CW-EPR譜圖的程序。Isotropic SpinFit用于模擬和擬合非粘性溶液的各向同性譜圖。SpinFit Liquids對(duì)這一功能進(jìn)行了擴(kuò) 展，增加了測(cè)定溶液中自由基翻滾速度（旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間）的功能。模擬不同運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下的譜圖，需要在能自動(dòng)確定運(yùn)動(dòng)狀態(tài) 的SpinFit Liquids中實(shí)現(xiàn)的不同理論描述。Anisotropic SpinFit用于模擬冷凍溶液和粉末的譜圖。

SpinCount無(wú)需參比物即可實(shí)現(xiàn)定量

. 高精度，無(wú)需參比物，通過(guò)二重積分直接利用原始數(shù)據(jù)計(jì)算出濃度

. 在SpinCount的計(jì)算中涵蓋了儀器參數(shù)的影響

. 集成于波譜儀的控制軟件，使得研究人員可在完成數(shù)據(jù)采集后立即輕松快速地實(shí)現(xiàn)自由基定量

圖1所示為，利用SpinCount進(jìn)行290 K溫度下的硫酸氧釩（VOSO4）水溶液的定量。用戶只需在SpinCount中利用區(qū)域限定工具 選擇二重積分區(qū)域，該區(qū)域的二重積分然后被換算成樣品中的總自旋數(shù)、自旋摩爾濃度及單位體積自旋數(shù)(spins/mm3)。

圖1：實(shí)驗(yàn)譜圖顯示為紅色。 通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)譜圖進(jìn)行二重積 分（藍(lán)色），SpinCount確定    出自旋數(shù)、摩爾濃度和自旋   數(shù)/mm3，如絕對(duì)自旋數(shù)報(bào)告 中所示。

一個(gè)重要的注意事項(xiàng)是不同的樣品條件。例如，觀測(cè)到的EPR譜圖會(huì)隨溫度的變化而變化，這會(huì)導(dǎo)致在不同溫度下研究的相同 樣品所獲得的二重積分不同。正如圖2所示，其中顯示了來(lái)自圖1的VOSO4樣品在150 K溫度下處于冷凍狀態(tài)時(shí)所觀測(cè)到的譜 圖。SpinCount在計(jì)算中考慮到了樣品溫度，因此可以提供一致的定量信息，而不受二重積分的變化影響。這也適用于未發(fā)生 相應(yīng)溫度變化時(shí)的物理狀態(tài)改變，因?yàn)閺囊簯B(tài)到固態(tài)的相變會(huì)以類似的方式導(dǎo)致譜圖改變。

圖2：在150 K溫度下研究來(lái) 自圖1的、處于冷凍狀態(tài)的相 同VOSO4樣品。SpinCount采 用相同的二重積分方法從實(shí) 驗(yàn)譜圖中計(jì)算出自旋數(shù)、摩 爾濃度及自旋數(shù)/mm3。

利用SpinFit模塊輕松快速地鑒定自由基

. 用于處理固態(tài)（Aniso SpinFit）和液態(tài)（SpinFit Isotropic和SpinFit Liquids）樣品中的自由基和過(guò)渡金屬物種

. 擁有鑒定時(shí)常見(jiàn)物種的譜圖庫(kù)

. 能夠鑒定和解析多個(gè)物種

. 與SpinCount輕松對(duì)接

. 自動(dòng)選擇動(dòng)態(tài)機(jī)制（SpinFit Liquids）

. 集成于波譜儀的控制軟件，使得研究人員可在完成數(shù)據(jù)采集后立即輕松快速地完成順磁性物質(zhì)鑒定

順磁性物質(zhì)的未成對(duì)電子會(huì)與它們的局部環(huán)境相互作用，從而產(chǎn)生可用于鑒定該物質(zhì)的特征EPR譜圖。SpinFit通過(guò)將原始數(shù) 據(jù)與一個(gè)小參數(shù)集進(jìn)行擬合來(lái)輕松實(shí)現(xiàn)物種鑒定，而用戶只需輸入很少的信息。當(dāng)順磁性物種未知時(shí)，SpinFit擁有一個(gè)全面 的常見(jiàn)自由基和過(guò)渡金屬譜圖庫(kù)，并帶有相應(yīng)的擬合參數(shù)，可幫助實(shí)現(xiàn)輕松快速的物種鑒定。由于處于液體和固體狀態(tài)的樣品 都能進(jìn)行研究，SpinFit提供了不同的參數(shù)選擇來(lái)滿足每種樣品狀態(tài)所需考慮的不同參數(shù)。圖3所示為，利用SpinFit Isotropic來(lái) 擬合在290 K下研究的VOSO4樣品的譜圖。用戶只需輸入或上傳一組起始參數(shù)，SpinFit Isotropic即可自動(dòng)找到精準(zhǔn)地?cái)M合該 譜圖所需的正確參數(shù)集。

圖3：處于液體狀態(tài)的VOSO4 樣品的實(shí)驗(yàn)譜圖（藍(lán)色），顯   示出由8條譜線組成的特征   裂分譜線?源自未成對(duì)電  子與MI  = 7/2釩核之間的超  精細(xì)耦合。擬合譜圖所用的   參數(shù)顯示在Spin Fitting窗口中，獲得的擬合譜圖顯示 為紅色。

與此同時(shí)，Aniso SpinFit能夠滿足擬合固態(tài)樣品的譜圖所需的額外參數(shù)。圖4所示為，利用Aniso SpinFit來(lái)鑒定來(lái)自圖2的、處 于冷凍狀態(tài)的VOSO4樣品。和液態(tài)樣品一樣，用戶可以輸入或者直接從譜圖庫(kù)上傳所有參數(shù)。

圖4：在150 K溫度下研究來(lái)自圖1和圖3的VOSO4樣  品時(shí)，獲得了與固態(tài)樣品一致的譜圖。進(jìn)行擬合時(shí)，Aniso SpinFit考慮了全   面描述固態(tài)樣品的譜圖所需 的額外參數(shù)。

SpinCount與SpinFit模塊聯(lián)用

. 即使信噪比低，也能實(shí)現(xiàn)高精度定量

. 解析多個(gè)重疊譜圖，以測(cè)定它們各自的濃度

. 借助SpinFit模塊也可獲得原始數(shù)據(jù)中包含的相同定量信息

前面的例子證明，SpinCount能夠?qū)?/span>EPR譜圖轉(zhuǎn)換成樣品中的自旋數(shù)，SpinFit模塊能夠擬合EPR譜圖。研究人員面臨的一個(gè)常 見(jiàn)問(wèn)題是，從含有多種順磁性物質(zhì)的樣品中獲取定量信息時(shí)，會(huì)受到譜圖重疊的干擾。在這種情況下，無(wú)法利用譜圖的二重積 分來(lái)獲得單個(gè)物種的定量信息。通過(guò)將SpinFit與SpinCount的功能相結(jié)合，即可獲得含多種物質(zhì)的樣品的定量信息。SpinFit 將實(shí)驗(yàn)譜圖與包含多種物質(zhì)的模型譜圖進(jìn)行擬合，并分離出單個(gè)譜圖。然后，SpinCount通過(guò)計(jì)算而非二重積分來(lái)獲得定量 信息。例如，圖5中的譜圖即源自于由三張譜圖組成的重疊譜圖，每張譜圖對(duì)應(yīng)于聚山梨酯的三種不同氧化產(chǎn)物之一。通過(guò) SpinFit Isotropic鑒定出三種聚山梨酯自由基后，再通過(guò)SpinCount分別進(jìn)行每種自由基的定量。如此，即使是含有多種物質(zhì)的 樣品，SpinFit Isotropic也能輕松實(shí)現(xiàn)樣品中單個(gè)物種的鑒定和定量。

圖5：實(shí)驗(yàn)譜圖（黑色）是從聚山梨酯自由基混合物中收 集到的原始數(shù)據(jù)。模擬譜圖   （藍(lán)色虛線）是分別顯示為黃色（烷基）、綠色（烷氧

基）和橙色（過(guò)氧基）的三張譜圖的總和。模擬譜圖是根據(jù) 各自所顯示的濃度對(duì)三份單張譜圖進(jìn)行加權(quán)求和所得。SpinFit Isotropic同時(shí)計(jì)   算出每張譜圖及三張譜圖之  和，使得每個(gè)物種可被單獨(dú)   地分離出并進(jìn)行分析。因此， 盡管譜圖重疊，SpinCount也 可利用該信息給出每個(gè)物種  的濃度。

圖6和圖7所示為，如何利用Aniso SpinFit 進(jìn)行混合物樣品的鑒定和定量。本例中的譜圖源自于處于不同配位環(huán)境下的過(guò)渡金 屬配合物。通過(guò)對(duì)照Anisotropic SpinFit的譜圖庫(kù)，在譜圖中鑒定出低自旋和高自旋Fe(III)信號(hào)。Aniso SpinFit再自動(dòng)找到精準(zhǔn) 地?cái)M合總譜圖所需的每個(gè)物種的正確參數(shù)。

圍6：實(shí)驗(yàn)譜圖（藍(lán)色）源自于由處于不同配位環(huán)境下的 三種血紅素配合物組成的混合物樣品。該數(shù)據(jù)改編自   （Ruetz, M.等人，遠(yuǎn)端配體   抑制硫化氫與人神經(jīng)球蛋白 的相互作用，J. Biol. Chem., (2017) 292, 6512-6528）。通  過(guò)對(duì)照Aniso SpinFit的譜圖  庫(kù)，實(shí)驗(yàn)譜圖被擬合（紅色） 成由三張不同Fe(III)譜圖疊   加而成的總譜圖，這三張譜   圖分別對(duì)應(yīng)于一種高自旋配 合物和兩種低自旋配合物。 單張譜圖顯示在圖7中。

圖7中的譜圖是Aniso  SpinFit從圖6的實(shí)驗(yàn)譜圖中鑒定出的單張譜圖。Aniso SpinFit根據(jù)每張譜圖對(duì)總譜圖的相對(duì)貢獻(xiàn)計(jì)算出 每個(gè)物種的濃度。

圍7：Aniso SpinFit鑒定出三 個(gè)Fe(III)物種，SpinCount再  對(duì)每個(gè)物種進(jìn)行定量。從絕  對(duì)自旋數(shù)報(bào)告中可以得出， 樣品中的高自旋Fe(III)物種   （紅色譜圖）濃度為2.3 μM， 低自旋Fe(III)物種（藍(lán)色譜圖）濃度為47 μM，另一個(gè)低 自旋Fe(III)物種（橙色譜圖） 濃度為12 μM。

除了重疊譜圖，研究人員還經(jīng)常面臨自由基濃度低導(dǎo)致數(shù)據(jù)的信噪比低的挑戰(zhàn)。濃度低可能是由樣本量受限或所研究反應(yīng)的 收率低所造成的內(nèi)在限制。雖然可以使用信號(hào)平均法，但這會(huì)非常耗時(shí)，或者可能受到快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的限制。在這種情況 下，SpinFit與SpinCount聯(lián)用同樣可以發(fā)揮良好的作用。高噪聲的實(shí)驗(yàn)譜圖被擬合成無(wú)噪聲的模擬譜圖，再通過(guò)模擬譜圖計(jì)算 出濃度。圖8中所示的條形圖，對(duì)比了重復(fù)測(cè)量自由基濃度為1 μM的樣品所得到的結(jié)果。通過(guò)二重積分確定濃度時(shí)，SpinCount 所得出的結(jié)果精度很低。如果先用SpinFit擬合高噪聲譜圖，再直接計(jì)算出濃度，則精度可大幅提高。

圖8：SpinCount通過(guò)對(duì)低濃  度樣品的EPR譜圖進(jìn)行二重 積分（橙色）來(lái)獲得定量結(jié)果 時(shí)，所得到的RSD為21%。如果先擬合高噪聲譜圖，再 直接計(jì)算出濃度（藍(lán)色），則 精度可以提高，而所得到的 RSD為3%。

SpinCount和SpinFit讓二維數(shù)據(jù)分析變得更簡(jiǎn)單

. 研究外部刺激因素對(duì)EPR譜圖的影響，從而構(gòu)建二維數(shù)據(jù)集

. 考慮到外部刺激因素的物種鑒定和定量

布魯克EPR波譜儀擁有豐富的附件，可用于進(jìn)行眾多不同類型的EPR研究。通常需要監(jiān)測(cè)樣品溫度或原位紫外輻照等常見(jiàn)外  部刺激因素對(duì)EPR譜圖的影響。獲得EPR譜圖在外部刺激因素的影響下隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，可供深入了解反應(yīng)機(jī)制和動(dòng)力學(xué)。 為了能以這樣的靈活性開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，布魯克EPR波譜儀提供了一些可選的一維和二維實(shí)驗(yàn)類型。但對(duì)于多維EPR數(shù)據(jù)，分析過(guò)程  可能非常耗時(shí)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，布魯克設(shè)計(jì)出了能夠逐層分析二維數(shù)據(jù)集的SpinCount和SpinFit軟件包。

圖9所示為，如何通過(guò)Isotropic SpinFit與SpinCount聯(lián)用，來(lái)測(cè)定混合物樣品（如圖5中的聚山梨酯）中濃度隨時(shí)間發(fā)生的變化。 雖然圖5中的單張譜圖能夠反映聚山梨酯發(fā)生氧化反應(yīng)的過(guò)程，但隨著時(shí)間的推移和反應(yīng)的進(jìn)行，每個(gè)物種的濃度也在上升  或下降。演變譜圖能夠反映每個(gè)物種的濃度隨反應(yīng)時(shí)間的推移而發(fā)生的變化。SpinCount的結(jié)果顯示，可以同時(shí)計(jì)算每個(gè)物種  的濃度。即，通過(guò)SpinFit和SpinCount的聯(lián)用，我們可以深入了解每個(gè)物種的反應(yīng)機(jī)制或動(dòng)力學(xué)，即使樣品中含有多種物質(zhì)。

圖9：通過(guò)采集隨反應(yīng)時(shí)間  而變化的EPR譜圖，來(lái)觀測(cè)  EPR 譜圖在聚山梨酯氧化  反應(yīng)過(guò)程中的演變趨勢(shì) 。 濃度與時(shí)間的關(guān)系圖表明  了，SpinCount如何在SpinFit  的幫助下，同時(shí)追蹤圖5中所  示的每個(gè)物種濃度，即使它  們的譜圖重疊。

圖10給出了一個(gè)利用SpinCount進(jìn)行硝苯地平自由基定量的例子。在本例中，硝苯地平自由基是通過(guò)紫外光照射1.5小時(shí)所產(chǎn) 生。從譜圖中的信號(hào)振幅不斷變大可以看出，自由基濃度隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。SpinCount通過(guò)逐一計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的二 重積分，來(lái)體現(xiàn)自由基濃度隨時(shí)間的變化。

圖10：硝苯地平自由基是通 過(guò)紫外光照射所產(chǎn)生。該圖 所示為，譜圖振幅隨照射時(shí) 間的延長(zhǎng)而不斷變大。絕對(duì) 自旋數(shù)報(bào)告表明，SpinCount 如何通過(guò)測(cè)定每個(gè)時(shí)間段的 濃度，來(lái)體現(xiàn)自由基濃度隨 紫外光照射時(shí)間的變化。

利用SpinFit Liquids進(jìn)行分子運(yùn)動(dòng)分析

. 自動(dòng)測(cè)定運(yùn)動(dòng)狀態(tài)

. 計(jì)算旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間

CW EPR信號(hào)可以分為不同的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。（1）各向同性極限狀態(tài)：非粘性溶液中的快速運(yùn)動(dòng)分子；（2）中間狀態(tài)：分為快速和慢 速運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，粘性溶液中的樣品或分子量較大以致于限制分子運(yùn)動(dòng)的分子；（3）剛性極限狀態(tài)：粉末、玻璃和冷凍溶液等固體 樣品。SpinFit Liquids模擬模塊適用于擬合所有液體樣品（包括中間狀態(tài)和各向同性極限狀態(tài)）的譜圖。模擬包含多個(gè)組分的 EPR譜圖，有助于研究復(fù)雜生物系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)。圖11所示為，與組氨酸激酶家族的一種蛋白質(zhì)結(jié)合的ADP自旋標(biāo)記類似物（ADP- NO）的EPR譜圖。從圖中可以看出，該譜圖是由兩個(gè)組分疊加而成：三條窄線代表溶液中的游離ADP-NO，而較寬部分代表與

蛋白結(jié)合的ADP-NO所產(chǎn)生的信號(hào)。分子運(yùn)動(dòng)速度通過(guò)旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間τ（單位：ns）來(lái)描述。旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間越短，分子運(yùn)動(dòng)速度

c

越大。SpinFit Liquids允許同時(shí)進(jìn)行多個(gè)組分的模擬，從而獲得兩個(gè)組分的分子動(dòng)態(tài)參數(shù)及它們的相對(duì)分?jǐn)?shù)。這些研究可為了 解ATP依賴蛋白及生物聚合物的功能提供重要見(jiàn)解。