脂類分子（lipids）薄層色譜（TLC）檢測（Rhodamin B）試劑盒產品說明書

主要用途

  脂類分子（lipids）薄層色譜（TLC）檢測（Rhodamin B）試劑是一種旨在使用通過薄層硅膠基質材料上，使用特定的有機溶劑，使脂類分子移動而呈現分離狀態，進而在羅丹明B的染色下，特異性地使脂類分子顯示熒光，以分析樣品中脂類分子狀況的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種人體和動物細胞和組織、植物組織，包括葉片（leaf）、谷粒（grain）、種子（seed）等樣本脂類分子的色譜分析。產品即到即用，操作簡捷，性能穩定，熒光清晰。

技術背景

脂類物質（LIPIDS）是一類脂溶性（疏水性）的自然分子，分為簡單脂質包括脂肪酸（FATTY ACID）及其衍生物甘油一脂、二脂、三脂；復合脂質包括磷脂、糖脂、硫脂以及脂蛋白；和中性脂質包括甘油、固醇類（STEROL）物質，例如膽固醇。脂類物質在機體中具有能量儲存的作用，是膜結構的組成成分和細胞信號分子。細胞漿脂滴（lipid droplet）的形成是正常細胞生理過程。脂滴由中性脂質構成，通常為甘油三酯，作為脂肪酸能量儲備；或膽固醇酯（cholesteryl ester），作為過多細胞膽固醇的存儲。薄層色譜（thin layer chromatography；TLC）是一種化合物和生物分子分離、識別、定量分析的常用方法，其分離鮮明、高度敏感、快速便捷、重復性好。通過薄層附著材料上，使用特定的有機溶劑，化合物分子移動而呈現分離狀態。脂類分子通常采用吸附（adsorption）機制進行分離，為三種常用機制：吸附、間隔、逆向等之一。   

產品內容

  清理液（Reagent A）            毫升

  萃取液（Reagent B）            毫升

  穩定液（Reagent C）            微升

  層析液（Reagent D）                毫升

  熒光液（Reagent E）            毫升

  層析板              塊

產品說明書               1份

保存方式

保存  穩定液（Reagent C）和  熒光液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；  萃取液（Reagent B）和  層析液（Reagent D）容易揮發，須密閉瓶蓋；有效保證6月

用戶自備

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞或組織

4℃微型臺式離心機：用于樣品操作

玻璃器皿（或100毫升燒杯）：用于薄層層析

加熱攪拌儀或烘箱：用于層析板干燥

長紫外或熒光成像儀：用于染色后觀察分析

實驗步驟

一、樣品準備

1． 準備好10⁷細胞或200毫克組織等待測樣品

2． 加入xx毫升  清理液（Reagent A）

3． 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器

4． 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞或組織（約20至40下）

5． 將所有勻漿物移入到2毫升離心管

6． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g

7． 小心移出200微升上清液到另一個新的2毫升離心管

8． 加入xx毫升  萃取液（Reagent B）

9． 渦旋震蕩10秒

10． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為5000g

11． 小心移出1毫升上層液相到另一個新的2毫升離心管

12． 加入xx微升  穩定液（Reagent C），混勻

13． 置于冰槽里備用（注意：可以容許揮發，濃縮樣品）

二、薄層色譜層析

1． 準備一個玻璃器皿：參考尺寸為 5厘米（長） X5厘米（寬）X 8厘米（高）或100毫升燒杯

2． 倒入xx毫升  層析液（Reagent D）（注意：液面處于底部之上1厘米）

3． 蓋緊玻璃器皿蓋子備用

4． 取出一塊  層析板

5． 置于加熱攪拌儀的加熱板上孵育3分鐘

6． 室溫下冷卻

7． 分別加上1至2微升（0.2厘米直徑）上述制備的樣品在層析板上一端，距離底邊1厘米以上（注意：可以并排加上4至5個樣品）

8． 放進上述準備好的玻璃器皿里（注意：點樣端朝下；  層析液（Reagent D）液面不能觸及點樣的樣品）

9． 蓋緊玻璃器皿蓋子

10． 觀察層析液在層析板上向上移動現象（10分鐘左右），直至上沿距離層析板頂端0.5厘米處

11． 小心取出層析板

12． 置于加熱攪拌儀的加熱板上孵育3分鐘，或直至層析液印跡消失

13． 室溫下冷卻

14． 將xx毫升  熒光液（Reagent E）倒入10cm玻璃培養皿里

15． 將層析板面朝下放進培養皿里浸泡數秒

16． 即刻置于暗室里晾干或置于加熱攪拌儀的加熱板上孵育30秒至1分鐘（注意：肉眼可見發白的斑點）

17． 即刻放到長紫外成像儀（365nm）或熒光成像儀（激發/散發波長550/590nm）成像：

脂類分子陽性呈現黃色或紫藍色斑點，背景為粉紅色

18． 計算Rf值

【樣品移動后斑點中心位置（厘米）—樣品起始斑點中心位置（厘米）】÷【層析液移動后的終端位置（厘米）—層析液起始位置（厘米）】

注意事項

1． 本產品為10次（30至50個樣品）操作

2． 操作時，須戴手套

3． 所有操作通風柜里進行

4．   萃取液（Reagent B）和  層析液（Reagent D）容易揮發，須密閉瓶蓋

5． 用戶可以使用甘油三酯（triglycerides）、脂肪酸（fatty acids）、甘油二酯（diglycerides）、類固醇（steroids）、甘油一酯（monoglycerides） 等作為脂類分子標準品

6． 用戶需要檢測糖脂或磷脂。例如甾醇糖甙（sterol glycosides）、磷脂酸（phosphatidic acid）、單半乳糖甘油二酯（monogalactosyl glycerides）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol）、二半乳糖二甘油酯（digalactosyl glycerides）、腦硫脂（sulfolipid）、卵磷脂（phosphatidyl choline）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidyl ethanolamine）、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidyl choline）、磷脂酰肌醇（phosphatidyl inositol）等，另購  特定層析液

7． 用戶可以通過熒光強度分析脂類分子含量變化

8． 用戶可以構建Rf層析移動圖像或曲線 

9． 如果沒有合適的熒光成像儀器，可以另購  特定顯色液

10． 染色完成后，即刻進行成像儀觀察

11． 參考圖像如下：

12． 本公司提供系列薄層色譜檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定熒光清晰