細(xì)胞NADPH氧化酶活性化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

  細(xì)胞NADPH氧化酶活性化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用化學(xué)發(fā)光分子光澤精受到NADPH氧化酶催化產(chǎn)生的超氧陰離子O₂^-的還原，然后在其還原過(guò)程中釋放能量，由此測(cè)定樣品中特異性氧化還原酶（oxidoreductase）的活性，即采用發(fā)光探測(cè)儀（Luminometer）測(cè)定其相對(duì)冷光單位（RLU）的變化，以此進(jìn)行測(cè)算酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)胞樣品（動(dòng)物或人體）還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）的特異活性檢測(cè)。用于免疫、血液研究、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

NADPH氧化酶，通常稱(chēng)為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或還原型輔酶II氧化酶，是機(jī)體防御機(jī)制中的重要元素。NADPH氧化酶由6個(gè)亞體構(gòu)成：Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase）和5個(gè)phox（吞噬細(xì)胞氧化酶；phagocytic oxidase）。其中主要包含細(xì)胞膜嵌合蛋白質(zhì)分子（gp91phox、p22phox、flavocytochrome b558等），以及位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其最特征性的酶活性是超氧化物歧化酶敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶被激活，將還原型輔酶Ⅱ（NADPH）轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸洼o酶Ⅱ（NADP），氧分子則獲得電子形成超氧陰離子O₂^-，由O₂^-又可生成H₂O₂和OH^－。其超氧陰離子產(chǎn)物具有殺死微生物的功能。NADPH氧化酶異常將導(dǎo)致慢性肉芽腫病（Chronic Granulomatous Disease；CGD）。基于底物NADPH，受到NADPH氧化酶的催化作用，產(chǎn)生超氧陰離子O₂^-，進(jìn)而超氧陰離子將化學(xué)發(fā)光分子光澤精（lucigenin）還原，并釋放能量，通過(guò)發(fā)光探測(cè)儀（Luminometer；470nm波長(zhǎng)）檢測(cè)，來(lái)測(cè)定NADPH氧化酶的活性。其反應(yīng)方式為：   

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A）         毫升

  裂解液（Reagent B）         毫升

  緩沖液（Reagent C）         毫升

  反應(yīng)液（Reagent D）         微升

  陰性液（Reagent E）           毫升

  底物液（Reagent F）          毫升

  專(zhuān)性液（Reagent G）           微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)                1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；  反應(yīng)液（Reagent D）和  底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于反應(yīng)物孵育

專(zhuān)用測(cè)定杯或黑色96孔板：用于冷光測(cè)定的容器

化學(xué)發(fā)光儀：用于冷光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

測(cè)讀開(kāi)始前，打開(kāi)化學(xué)發(fā)光儀，設(shè)定儀器內(nèi)溫度為30℃預(yù)熱和運(yùn)行程序（清洗步驟等），然后關(guān)掉實(shí)驗(yàn)室的燈光。將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；  反應(yīng)液（Reagent D）和  底物液（Reagent F）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升  清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升  裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管，置于冰槽里——此為細(xì)胞總蛋白

15． 同時(shí)加入xx微升  裂解液（Reagent B）到顆粒管

16． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

17． 在冰槽里用研磨棒勻化組織顆粒（約80下）

18． 轉(zhuǎn)移到到另一個(gè)新的預(yù)冷的1.5毫升離心管——此為細(xì)胞膜蛋白

19． 分別移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－   30030.1）

20． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)備

1． 從-70℃取出上述制備的待測(cè)樣品，置于冰槽里（注意：檢測(cè)前樣品須澄清；參見(jiàn)注意事項(xiàng)7）

2．   緩沖液（Reagent C）室溫下預(yù)熱

3． 設(shè)定好化學(xué)發(fā)光儀（溫度為30℃）：整合10秒，間隔1分鐘，測(cè)定5分鐘，并置零（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)9）

三、 背景對(duì)照測(cè)定（選擇步驟）

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的專(zhuān)用測(cè)定杯

2． 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升  底物液（Reagent F）

4． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘

5． 加入xx微升  陰性液（Reagent E）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放進(jìn)化學(xué)發(fā)光儀里

8． 整合10秒，測(cè)讀5分鐘，獲得RLU（RELATIVE LIGHT UNIT）讀數(shù)，此為背景空對(duì)照

四、樣品總活性測(cè)定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的專(zhuān)用測(cè)定杯

2． 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升  底物液（Reagent F）

4． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

5． 加入100微升待測(cè)樣品（注意：300微克細(xì)胞膜蛋白或500微克細(xì)胞總蛋白；樣品須溶解；參見(jiàn)注意事項(xiàng)7）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放進(jìn)化學(xué)發(fā)光儀里，

8． 整合10秒，測(cè)讀5分鐘，獲得RLU（RELATIVE LIGHT UNIT）讀數(shù)，此為樣品總活性

五、樣品非特異活性測(cè)定（選擇步驟）

1． 準(zhǔn)備1個(gè)1.5毫升離心管

2． 加入xx微升  專(zhuān)性液（Reagent G）

3． 加入100微升待測(cè)樣品（注意：300微克細(xì)胞膜蛋白或500微克細(xì)胞總蛋白；樣品須溶解；參見(jiàn)注意事項(xiàng)7）

4． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置5分鐘

5． 放進(jìn)冰槽里備用

6． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的專(zhuān)用測(cè)定杯

7． 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent D）

8． 加入xx微升  底物液（Reagent F）

9． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

10． 加入上述冰槽里的xx微升含有  專(zhuān)性液（Reagent G）和待測(cè)樣品的溶液

11． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

12． 即刻放進(jìn)化學(xué)發(fā)光儀里

13． 整合10秒，測(cè)讀5分鐘，獲得RLU（RELATIVE LIGHT UNIT）讀數(shù)，此為樣品非特異活性

六、 樣品活性分析

1．計(jì)算公式

2．繪制RLU讀數(shù)（Y軸）和時(shí)間（X軸）關(guān)系曲線

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為21次（10個(gè)樣本）操作，包括1次背景對(duì)照測(cè)定

2． 操作時(shí)，須戴手套

3．   反應(yīng)液（Reagent D）和  底物液（Reagent F）注意避光

4． 測(cè)讀的所有步驟均須在暗室里進(jìn)行

5． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次

6． 背景測(cè)定和樣品非特異活性測(cè)定可以省略

7． 樣品檢測(cè)前，須溶解和澄清 

8． 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻測(cè)定

9． 反應(yīng)測(cè)定值隨著時(shí)間增加而逐漸升高，通常5分鐘達(dá)到峰值，并趨于穩(wěn)定；如果繼續(xù)升高，測(cè)定可以持續(xù)15分鐘

10． 測(cè)定值由低到高變化，表明有酶活性

11． 測(cè)定后，專(zhuān)用測(cè)定杯須清洗

12． 建議待測(cè)樣本總蛋白濃度為500微克/100微升（300微克膜蛋白+200微克總蛋白）或純化細(xì)胞膜蛋白為300微克/100微升；如果樣本酶活性過(guò)低，則可以增加樣本量（本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒   30030.1）

13． 如果檢測(cè)純化細(xì)胞膜蛋白的酶活性，可以加入花生四烯酸（Arachidonic Acid）激活處理

14． 樣品實(shí)際活性是指超氧化物歧化酶敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，去除其它干擾因素

15． 本公司提供系列氧化酶類(lèi)技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確