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紅外光譜儀是藥物研究及生產(chǎn)必備的分析儀器之一，而粉末壓片幾乎是每個測試人員的必備技能。盡管壓片工作看起來簡單重復(fù)且沒有太多的技術(shù)含量，但是想要采集到一張能夠與藥典標(biāo)準(zhǔn)紅外譜圖相媲美的譜圖數(shù)據(jù)卻并不是一件輕松的事情。2023 年 10 月，中國藥典《藥品紅外光譜集》（2023 年版）正式發(fā)布。安捷倫技術(shù)人員經(jīng)過多年的工作經(jīng)驗(yàn)的積累，將通過紅外譜圖評價標(biāo)準(zhǔn)、紅外實(shí)驗(yàn)室基本要求、儀器準(zhǔn)備、粉末壓片標(biāo)準(zhǔn)工作流程、粉末壓片制樣過程注意事項(xiàng)以及譜圖常見問題解析等六個方面對標(biāo)準(zhǔn)紅外譜圖采集流程進(jìn)行詳細(xì)介紹。
紅外譜圖評價標(biāo)準(zhǔn)
高質(zhì)量紅外光譜圖通常需要滿足以下條件：
基線平直且縱坐標(biāo)在 85-100%T 之間
最強(qiáng)吸收峰縱坐標(biāo)在 5-15%T 之間
在 2200-2400 cm-1 處沒有 CO2 吸收峰干擾
在 3400 cm-1 及 1600 cm-1 附近區(qū)域沒有水峰干擾
光譜信噪比好且譜線平滑
下圖為使用 Cary630 FTIR 光譜儀采集的鹽酸法舒地爾標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜圖。
圖 1. Cary630 FTIR 光譜儀采集的鹽酸法舒地爾標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜圖
紅外實(shí)驗(yàn)室基本要求
使用紅外光譜儀的用戶實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備以下條件：
實(shí)驗(yàn)室溫度控制在 25℃ 左右，濕度控制在 50% 以下，并保證日常恒溫恒濕要求
用于儀器波數(shù)準(zhǔn)確度及光度精度驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯（PS）薄膜
儲備溴化鉀、氯化鉀及石蠟油等常規(guī)試劑，并放置在干燥皿內(nèi)備用
用于樣品壓片制備過程中的紅外烘烤燈
紅外壓片機(jī)、模具及配套的壓片工具
儀器準(zhǔn)備
安捷倫 Cary630 FTIR 光譜儀體積小巧、性能穩(wěn)定，且滿足《中國藥典》對紅外光譜儀的所有指標(biāo)要求。儀器采用主機(jī)與附件分體式的設(shè)計，用戶可根據(jù)測試需求及樣品類型選擇合適的附件。藥物粉末壓片測試時，可選擇主機(jī)搭配透射樣品倉附件實(shí)現(xiàn) 400-4000 cm-1 范圍內(nèi)紅外譜圖的采集。儀器軟件為符合 21 CFR Part11 法規(guī)要求的 MicroLab PC 軟件，為藥物研發(fā)及藥物質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室提供安全的數(shù)據(jù)完整性保證。
粉末壓片時，測試條件如下：
儀器分辨率：2 cm-1
波長范圍：400-4000 cm-1
掃描次數(shù)：32 次
藥物粉末壓片標(biāo)準(zhǔn)工作流程
取 1-2 mg 樣品與 100-200 mg 干燥后的溴化鉀粉末（取決于藥物紅外吸收的強(qiáng)弱特性，二者比例可適當(dāng)調(diào)整）放入瑪瑙研缽中混合研磨，直至得到均勻、超細(xì)的顆粒。
組裝壓片磨具，將底部壓頭光面朝上放入模具中。將樣品緩慢加入模具中并使其均勻地散布在底面壓頭上。
把上壓頭光面向下放入模具，壓上壓桿。將模具放入壓片機(jī)中壓制，壓力調(diào)整到 20 MPa 左右，保持 1-2 min。
轉(zhuǎn)動卸壓閥，緩慢卸掉壓力并取出模具。用壓頭反向取出片子并檢查片子的均勻程度和透明度。
將樣品放入樣品支架并置于樣品倉內(nèi)進(jìn)行測量。
粉末壓片制樣過程注意事項(xiàng)
為了能夠獲得效果良好的譜圖，注意事項(xiàng)總結(jié)如下：
1
溴化鉀及氯化鉀粉末易吸水，日常應(yīng)放置在干燥皿中保存。使用前須在 120℃（或 150℃）干燥箱中恒溫干燥 2 小時以上。
2
為避免顆粒散射造成的基線傾斜問題，樣品及試劑顆粒應(yīng)進(jìn)行充分研磨至 2.5um 以下，以研磨過程中粉末不再有顆粒感為宜。
3
如樣品和試劑在研磨過程中發(fā)生離子交換，則需要更換試劑類型或改用糊法進(jìn)行測試。
4
如果壓出的片子易碎，請確認(rèn)是否與加入粉末太少、壓力過大或壓力保持時間太長有關(guān)，可通過增加粉末體積或降低壓力等方式來避免這種情況。
5
如果片子與模具粘合在一起、脫模困難，需要確認(rèn)是否由樣品易吸水或比較粘稠的特性引起。若是樣品特性原因，可適當(dāng)減少樣品加入量；若是室內(nèi)濕度過大或模具未清洗干凈引起，可降低室內(nèi)濕度或在紅外烘烤燈下制備樣品以及深度清洗模具等來優(yōu)化。
譜圖常見問題解析
獲得紅外譜圖后，分析譜圖可發(fā)現(xiàn)制樣過程中存在的問題并優(yōu)化制樣過程。經(jīng)常遇到的幾種情況分別為：
加入樣品量不合適
譜圖吸收峰的強(qiáng)弱，可判斷加入的樣品量的多少。如圖 2 所示，光譜 1 中所有峰為尖峰，但吸收峰強(qiáng)度較弱，可判定為加入樣品量不足；光譜 2 中多個峰平頂飽和，可判定為加入樣品量過多。根據(jù)峰強(qiáng)度的強(qiáng)與弱，可通過減少或者增加樣品加入量來優(yōu)化。
圖 2. 光譜 1 中加入樣品量太少，吸收較弱；光譜 2 中加入樣品量太多，峰飽和
基線傾斜
透過率光譜越高波數(shù)越向下傾斜，如圖 3 所示。通常是樣品與試劑研磨不充分，光在樣品上發(fā)生散射造成的。
圖 3. 研磨不充分樣品譜圖對比
如圖 4 所示，分別制備不同顆粒粒度樣品的溴化鉀壓片并采集紅外譜圖。從圖中可以看出，隨著顆粒粒徑減小，透射譜圖基線的傾斜問題得到明顯改善。
圖 4. 不同顆粒粒度樣品的溴化鉀壓片譜圖
樣品與試劑發(fā)生離子交換
在樣品壓片過程中，試劑與樣品可能發(fā)生離子交換。如一些有機(jī)鹽，可選擇更換試劑類型或者采用糊法的方式來避免。以鹽酸氯酯醒為例，如使用 KBr 作為研磨試劑，則會發(fā)生離子交換導(dǎo)致譜圖發(fā)生變化，此時可選用 KCl 為研磨試劑進(jìn)行壓片。如圖 5 所示，可以看到分別使用兩種試劑壓片后的譜圖差異。
圖 5. 分別使用 KBr 及 KCl 作為研磨試劑進(jìn)行鹽酸氯酯醒壓片后采集的紅外譜圖
二氧化碳干擾峰影響
用戶經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)在 2200-2400 cm-1 處出現(xiàn)雜峰，這主要是因?yàn)榭諝庵卸趸紳舛茸兓鸬模鐖D 6 所示。從圖中可見，此特征峰有時為正峰，有時候?yàn)榈狗澹斐蛇@種差異的原因是掃描背景譜圖與掃描樣品譜圖時環(huán)境中二氧化碳的濃度發(fā)生了變化。所以在進(jìn)行紅外譜圖采集的過程中，工作人員應(yīng)盡量避免對著樣品倉的位置呼氣，同時要盡量降低背景與樣品掃描的時間差。
圖 6. 二氧化碳對光譜影響示意圖
結(jié)語
以上經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，希望能夠?qū)θ粘９ぷ髦行枰褂眉t外光譜儀的用戶帶來一些啟發(fā)。通過對工作細(xì)節(jié)的優(yōu)化，能夠輕松獲得一張可與藥典中標(biāo)準(zhǔn)紅外譜圖相媲美的結(jié)果。
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