常見的細胞污染分為以下幾類∶
細胞培養中常見的生物污染類型有好幾種,分別是細菌污染、支原體污染、黑膠蟲污染、真菌污染、以及細胞交叉污染。他們在細胞培養中污染的特點如下:
一:細菌污染

細菌污染:細菌是一種原核細胞微生物,其大小以微米(μm)計。常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等,革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見。
一旦發生細菌污染較易發現,多數情況下培養液短期內顏色變黃,表明有大量酸性物質產生,出現明顯混濁現象;有時靜置的培養液液體初看不混濁,但稍加振蕩,就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察,可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時可取少量培養液涂片染色檢查以證實細菌種類;有的培養液改變不明顯而又疑有污染,可取出少量培養液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種,也可取10ml細胞懸液以100rpm離心5min,沉淀中加入無抗生素的培養液2ml,置于37℃培養,24h可得結果。污染后細胞發生病理改變,胞內顆粒增多、增粗,最后變圓脫落死亡,造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。
看到這種,別猶豫了你的細胞被污染了,那么怎么辦呢,基本原則立馬扔掉,別擴大污染,如果你的細胞真的十分寶貴,先用帶有雙抗的PBS反復沖洗幾遍,然后再培養液中加入硫酸慶大霉素、新霉素(50ug/ml)等,培養3天后換成帶有雙抗的培養液培養。
二.支原體污染
特征:最小的微生物,無法通過光學顯微鏡看見,但可通過電鏡觀察到。感染支原體的細胞,在某一時間點碎片突然增多,隨著傳代,細胞狀態顯著變差。支原體污染可通過氣溶膠傳播,影響同一細胞房其他細胞。
鑒定方法:PCR法、顯色法、熒光染色法等。
處理方法:若細胞狀態尚可,添加支原體抑制劑培養2-3代可轉陰;若細胞狀態很差,建議消殺后丟棄。

三、黑膠蟲污染
特征:無明確定義,鏡下無法直接觀察到。主要表現為細胞狀態差,黑點和碎片多,布朗運動。通過檢測發現主要為支原體污染,部分為未知的增殖不明顯的微生物污染。
處理方式:若細胞狀態尚可,添加黑膠蟲/支原體抑制劑培養2-3代可轉陰;若細胞狀態很差,建議消殺后丟棄。
四、真菌污染
特征:呈鏈球狀或絲狀。常形成肉眼可見的菌落,培養基顏色無變化或變紫,僅對局部細胞影響較大,其他地方生長正常。會形成孢子,容易污染其他細胞。
處理方法:真菌污染較難除,不建議保留,建議消殺后丟棄。

五、細胞交叉污染
特征:即不同的細胞混雜在一起
鑒定方法:
同種屬:STR鑒定,多等位基因數大于3個。
(需考慮本身的遺傳背景,如EA.hy 926為融合細胞,本身就包含兩套遺傳信息)
不同種屬:PCR法,對種屬特異性基因進行擴增,不同種屬產物大小不同。
處理方法:建議重新引種。

六、細胞污染的處理
應對細胞污染的最好對策是預防!預防!再預防!養細胞要勤快,平時所用到的耗材、器皿等要及時高壓滅菌,滅菌后超過一周未使用也應重新滅菌。配制的培養基、胰酶、PBS等最好在一周內用完。同時,也應每天查看一下細胞狀態。在細胞房內應盡量少地走動,盡量少地說話,若咳嗽或噴嚏時務必背向超凈臺。
細胞污染后處理方式是丟棄。當個別細胞十分珍貴無法丟棄時可盡力“急救”一下。
那么如何急救呢?
1,判斷污染源。一旦發現細胞有污染的跡象或已污染,立即判斷可能的污染源︰有無操作不當?培養基、胰酶、PBS等顏色、澄清度是否正常?
2,及時處理。若確定現有的培養基、胰酶、PBS可用,則繼續使用;若無法確定則新配培養基、PBS、胰酶,原有的液體在確定是否污染后再做處理。
現以貼壁細胞為例向大家介紹下細菌污染時如何“急救”∶
1),立即棄去培養容器內的培養基,以PBS潤洗2~3次,加入胰酶處理至細胞形態略有改變但未脫離容器時棄去胰酶,加入PBS輕輕潤洗1遍;
2),加入20×雙抗,浸泡細胞3~5min,棄去雙抗;
3),加入新鮮的培養基(含10×雙抗)培養12 h;
4),12 h棄去培養基以PBS潤洗2~3遍后加入培養基(含10×雙抗);
5),傳代時以較小轉速離心(如平時以1000 r/min離心,則可降為800~900r/min離心),仍以含10×雙抗的培養基培養;
6),若第二代后鏡下找不到細菌,則第三代起可正常培養。正常培養48 h后無反彈則可認為污染已清除。
若為霉菌污染,在以PBS潤洗2~3遍后換液,無需加入高濃度雙抗。培養48 h后污染未再次出現即可。
若為真菌污染,在PBS潤洗、換液后可加入兩性霉素B(兩性霉素B有細胞毒性,不推薦使用),也可加入300 ug/mL氟康唑培養,污染控制后改用150 ug/mL培養2~3代。
若懷疑支原體污染,則可進行PCR檢測或直接使用支原體清除試劑(如∶某恒生物)。也可購買環丙沙星注射液,于超凈臺內打開直接添加到培養基中,以20 ug/mL濃度2代后改用10 ug/mL濃度持續培養約2周。
附∶常用抗生素劑量和抗菌范圍

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