KRAS熱度已經消退了？NO...據調查，現在除傳統針對KRAS靶點小分子藥物外，更多玩家嘗試新興療法征服這一“不可成藥”的難題，如疫苗，TCR-T療法等。KRAS可以被細胞外信號以及來自細胞器等亞細胞結構的信號所激活。在正常的生理環境下，野生型KRAS主要處于不活躍的GDP結合狀態。信號促使KRAS脫離GDP，并與GTP結合，將KRAS轉化為激活狀態。激活的KRAS能夠結合并激活效應蛋白，如RAF激酶、PI3K和RalGDS，促進下游級聯的信號通路，如MAPK、PI3K和Ral-GEFs通路。這些信號通路通過細胞復制、生長、分化和促進細胞周期進程。一個激活的致癌KRAS基因導致一個突變的KRAS蛋白，由于GTP水解率大大降低，異常長時間保持其活性GTP結合狀態。當KRAS蛋白被困在“ON”位置時，下游效應通路也保持活躍，細胞增殖率保持很高。其他仍然活躍的效應通路包括那些促進腫瘤發展過程的通路，如有絲分裂、細胞遷移、腫瘤侵襲和血管生成。 一、高通量篩選試劑盒HTRF®技術提供均相，免洗KRAS結合檢測試劑盒，通過這些已驗證的試劑盒，可直接用于抑制劑篩選，無需優化，每個試劑盒配有重組蛋白、檢測試劑和緩沖液。如下圖所示，使用抗Tag1-SOS1（供體）和抗Tag2-XL665（受體）檢測Tag1-SOS1與Tag2-KRAS-G12C之間的相互作用。當供體和受體抗體由于SOS1和KRAS-G12C結合而接近時，供體抗體的激發觸發向受體抗體的熒光共振能量轉移（FRET），受體抗體在665nm處特異性發射。這種特異性信號與KRAS-G12C/SOS1相互作用的程度成正比。因此，化合物或抗體阻斷KRAS-G12C/SOS1的相互作用會導致HTRF®信號的減少。  
 使用已知抑制劑對試劑盒進行驗證，均獲得相應較好的IC50并且與已報道文獻結果相一致。 
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 二、KRAS靶點相關蛋白全部KRAS相關蛋白均已原核表達系統（E.coli）進行表達。通過HTRF方式驗證其結合活性。 1、KRAS WTThe KRAS-WT activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS- WT protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.

2.KRAS-G12CThe KRAS-G12C activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G12C protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal. 3.KRAS-G12D The KRAS-G12D activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G12D protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal
4.KRAS-G12RThe KRAS-G12R activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G12R protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.

5.KRAS-G12VThe KRAS- G12V activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS- G12V protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.
6.KRAS-G13CThe KRAS-G13C activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G13C protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.
7.KRAS Q61HThe KRAS-Q61H activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-Q61H protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.

8.SOS1 

9.RAF
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*以上KRAS蛋白無GTP bound，如需GTP bound，可聯系優寧維。上述蛋白，常規規格有：50μg，100μg和1mg，如需更大規格，可聯系優寧維定制。 三、Anti-Tag抗體話說，不想用試劑盒的情況下，如何建立assay呢？蛋白已經有了，還差檢測抗體...這不就來了！Anti-Tag的HTRF熒光抗體，在實現高通量，操作簡便等其他技術優勢的同時，可以為assay的建立提供最大的靈活性。無關乎蛋白本身，僅針對標簽如His，GST，FLAG等，選擇對應的配對抗體即可實現實驗方法學開發。比如：參考上述蛋白KRAS G12C（his Tag）和SOS1（GST tag），選擇抗體配對有幾種方式可供參考：

 下圖為Anti-GST-Tb SOS1與Anti-his-XL665 KRAS G12C搭配組合展示。 
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 三、下游磷酸化蛋白檢測Alpha®和HTRF®技術基于細胞水平進行下游KRAS信號通路的研究，包括MAPK、PI3K和Ral-GEFs通路。這些細胞信號分析能夠區分化合物調節下游KRAS通路的功效。HTRF®仍然利用夾心法原理，標記的特異性抗體識別磷酸化蛋白和總蛋白從而進行定量檢測。全過程無需洗滌，特異性好，靈敏度高。 

下圖為p-ERK（圖左）和p-NFkB（圖右）磷酸化試劑盒靈敏度與WB對比，靈敏度高出30倍不等。

與HTRF®技術不同，Alpha®雖然也是均相檢測檢測技術，但其基于化學發光原理，利用兩個微珠進行檢測來實現更低的實驗背景和超高靈敏度。一個抗體被生物素化并與鏈霉親和素包被的供體微珠結合，受體微珠則直接與另一個抗體結合。抗體與磷酸化蛋白（總蛋白）結合使供體和受體微珠靠近。供體微珠的激發使得單線態氧擴散至受體微珠，從而發射615nm波長的光信號。Alpha®的檢測信號與樣本中存在的磷酸化蛋白（總蛋白）的數量成正比。Alpha®原理如下圖。 

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 四、3D細胞增殖


基于ATP的發光法測定細胞增殖和細胞毒性的分析原理。用適當緩沖液直接裂解細胞后，對細胞ATP進行定量。在裂解細胞釋放的ATP作用下，ATP與添加的熒光素反應產生光。

ATPlite 3D and ATPlite 1step 3D Assay 操作流程如下：

ATPlite 3D檢測可以允許細胞密度較高情況下進行檢測，并且比2D檢測效果明顯。
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四、微孔板耗材1.3D細胞培養板①板底為高度生物相容的，超低吸附力聚合物包被du有的合成聚合物MPC，源于細胞膜組分，與極性基團的磷脂（磷脂酰膽堿）具有相同的結構，提供自然生長環境，并消除批間差異。②易形成形態大小均勻的球體細胞球體高質量形成率，細胞形態均已一致，板材的均勻性高，可隨時聚焦進行圖片拍攝，提供重復性更高的數據及更高效更高質量的成像。③無需更換培養基實驗的佳選擇圓底板，性價比高。
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