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新生兒促甲狀腺素（TSH）檢測試劑盒使用說明書
德國IBL進口原裝，酶標儀定量檢測
德國IBL中國*代理商“深圳科潤達生物工程有限公司”竭誠為您服務
中國SFDA注冊：國食藥監械（進）字2011第2400471號
【產品標準編號】SFDA（I）20112400471
用途
本試劑盒為體外測定試劑盒，用酶聯免疫法定量測定濾紙片上干燥血標本中的促甲狀腺素（hTSH），作為新生兒先天性甲狀腺機能減退癥（簡稱“甲低”）的篩查。
前言
先天性“甲低”是以外周血甲狀腺激素（T3和T4）水平降低為特征的新生兒內分泌障礙。世界范圍內先天性“甲低”的平均發病率為1：4，000。此疾病特 點是外周血中甲狀腺激素低于正常水平，而促甲狀腺素高于正常水平。人的促甲狀腺素是由腦垂體前葉合成分泌的。他調節和刺激甲狀腺產生甲狀腺激素。甲狀腺激 素缺乏刺激hTSH分泌，存在負反饋。hTSH水平也受下丘腦分泌的促甲狀腺素釋放激素的影響。因此，新生兒外周血促甲狀腺素濃度提高，可作為篩查判斷先 天性“甲低”的根據。
新生兒出生前后時期和出生后幾個月內甲狀腺激素的不足將妨礙其大腦的正常發育，其zui終結果是導致不可修復的大腦功能障礙和骨骼神經系統發育障礙。早期篩查出新生兒先天性“甲低”，用甲狀腺激素的替代治療可防止大腦的發育不良。
原理
1．新生兒促甲狀腺激素酶聯免疫測定法（Neonatal hTSH EIA）是一種固相雙位點酶免疫測定法，濾紙片上干燥血標本洗提出hTSH，同時與包被在酶標板上抗hTSH的單克隆分子和辣根過氧化物酶標記的抗hTSH亞單位的第二抗體結合。
2．過剩的酶結合物和未結合的hTSH被洗滌去掉，加入四甲基聯苯胺（TMB）底物溶液進行酶反應。
3．加入1N硫酸（H2SO4）溶液終止酶反應，用酶標讀數儀在450nm下測定吸光度值。
試劑盒組成
試劑盒貯存在+2—+8℃。
不要使用過期試劑。
試劑盒使用前，所有試劑及酶標板放置+18—+25℃平衡30分鐘。
TMB底物是光敏感性的，應避免光照。
所有試劑組份一旦開啟，密封袋或蓋子緊緊密封。
1 抗-hTSH包被的反應板 10塊（12×8孔）
2 辣根過氧化物酶標記的抗-hTSH酶結合物（濃縮100X） 2.5ml
3 酶結合物稀釋液 250ml
4a TMB顯色劑（25X） 9.5ml
4b 底物緩沖液 250ml
5 洗滌液（濃縮10X） 220ml
6 hTSH標準品 1張5套，每套6個標準品，用錫箔袋包裝。
每批標準品的數值是不相同的，每套試劑盒內都有確切的數值。
7 hTSH質控 C1-C2 1張5套，含2個質控，用錫箔袋包裝。
每批質控的數值是不相同的，每套試劑盒內都有確切的數值。
8 終止液 0.45M 硫酸
酶標反應板的塑料粘膠貼 10張
質控和標準品的TSH數值表 1張
試劑的準備
表1 試劑的準備
| 試劑 | 準備 | 開啟或稀釋后的穩定性（+2—+8℃） |
| 1 抗-hTSH包被的反應板 | 直接使用 | 2個月 |
| 2 辣根過氧化物酶標記的抗-hTSH酶結合物（濃縮） | 臨用前，用酶結合物稀釋液按1：100（1+99）稀釋配制。（見表2） | 5個月 廢棄未用完的酶結合物溶液 |
| 3 酶結合物稀釋液 | 供配制酶結合物溶液用 | 10個月 |
| 4 底物溶液 | 臨用前，用底物緩沖液（4b）按1：25（1+24）將TMB顯色劑（4a）稀釋成底物溶液。 | 廢棄未用完的底物溶液 |
| 4a TMB顯色劑 | 直接供配制底物溶液用 | 6個月 |
| 4b 底物緩沖液 | 直接供配制底物溶液用 | 6個月 |
| 5 洗滌液（濃縮） | 用蒸餾水按1：10（1+9）稀釋 | 6個月 廢棄有渾濁的洗滌液 |
| 6 hTSH標準品 | 直接使用 | 3個月 |
| 7 hTSH質控 8 終止液 | 直接使用 直接使用 | 3個月 6個月 |
表2酶結合物和底物溶液的準備配制
| 酶標板數（塊） | 酶結合物（2） （ml） | 酶結合物稀釋液（3）（ml） | TMB-顯色劑（4a）（ml） | 底物緩沖液（4b）（ml） |
| 1 | 0.24 | 24 | 1 | 24 |
| 2 | 0.42 | 42 | 2 | 48 |
| 3 | 0.62 | 62 | 3 | 72 |
| 4 | 0.82 | 82 | 4 | 96 |
| 5 | 1.00 | 100 | 5 | 120 |
| 6 | 1.20 | 120 | 6 | 144 |
| 7 | 1.38 | 138 | 7 | 168 |
| 8 | 1.58 | 158 | 8 | 192 |
| 9 | 1.76 | 176 | 9 | 216 |
| 10 | 2.00 | 200 | 10 | 240 |
試劑盒中未提供的所需器材
蒸餾水；量筒；試劑瓶；加樣槍；吸水紙；計時器；橡膠手套
—酶標讀數儀 如芬蘭Labsystems Multiskan
—板的振蕩器 如芬蘭Labsystems iEMS Incubator/Shaker
—洗板機 如芬蘭Labsystems Multiwash
—8-道加液器（50—300μl）
—（3mm）打孔器
標本的收集和處理
嬰兒出生后3—5天，用濾紙從嬰兒的足跟取一滴血液，獲得帶血點（直徑0.8cm）的濾紙片，并確信濾紙片被血樣*浸透，帶血樣的濾紙片至少晾干2小時，帶血樣的干燥濾紙片（密封）在+4--+8℃至少可貯存4個月時間。
濾紙片標本的收集一定是單一的一滴血液，否則會造成假陽性結果。這一滴血在濾紙片上擴展的面積要足夠大，保證血液從濾紙的上面均勻浸透到下面，浸透不* 會造成測定的TSH量偏低。采血點應稍微靠近足跟的左表面皮膚，抹掉*滴血，用隨后形成的血滴。為提高嬰兒足跟針刺點血流，嬰兒足跟可用熱的（約 42℃）濕毛巾敷3分鐘。不要過分擠壓足部，否則會導致溶血或組織液的稀釋。一滴血形成后，用濾紙片輕輕地接觸血滴，但不要向足跟擠壓，從濾紙背面觀察血 滴透過濾紙。
一般一個嬰兒要收集三個血點（三滴血）的濾紙標本，血樣點應避免污染。置濾紙于水平位置，室溫空氣干燥2至6小時。注意不要加熱，不要堆積，不要接觸其他 物品表面。將每個帶血標本的濾紙片置于一個信封中，并郵寄到新生兒篩查中心實驗室。實驗室收到標本應放置+4--+8℃防濕保存，并及時篩查。
標本收集卡應注明以下內容：醫院名稱，編號，嬰兒姓名，出生 年 月 日，住院號，家庭地址，和采血日期。
警告—有潛在生物危險的材料
標準品，對照雖然已經滅活，但不能認為無傳染性，應認為有潛在的傳染可能。標本等的處理按生物安全二級水平處理。詳見美國疾病控制中心國立健康研究所的“微生物和生物醫學實驗室生物安全”手冊。（1984）
操作步驟
操作步驟簡圖
| *步 | 用打孔器在濾紙上打下3mm直徑的標準品，質控和標本，并依次放置到包被板孔內。 |
| 第二步 | 用酶標記抗體稀釋液將酶標記抗體按1：100倍稀釋，每孔加入200μl。 室溫振動（650rpm）孵育2小時 或室溫振動（650rpm）15分鐘后，+4℃不振動過夜。 |
| 第三步 | 去掉標本的濾紙片，洗滌液洗滌4次，每次加入300ul。 |
| 第四步 | 加入200μl的底物溶液 室溫避光孵育15分鐘 |
| 第五步 | 加入100μl1N終止液 在波長450nm下測定吸光度值。 |
檢測前，把所有的試劑和酶標反應板放置室溫+20--+25℃預熱30分鐘。
1.用打孔器在濾紙上打下3mm直徑的標準品（雙孔），質控（雙孔）和標本（每孔1片），并依次放置到抗-hTSH包被的酶標板孔內。
注意：圍繞血樣點中央對稱地打孔。
2.用酶標抗體稀釋液將酶標抗體按1：100倍稀釋，每孔加入200μl酶結合物溶液。
3.孵育
A：室溫（不超過+30℃）振動（650rpm）孵育2小時。（貼上粘紙）
B：室溫振動15分鐘后，+4℃不振動過夜。（貼上粘紙）
注意：當室溫>+30℃時，應選擇過程B。
4.倒去溶液和吸去濾紙片。
5.洗滌
——手工洗滌
每孔加入300μl的洗滌液（試劑5）；
倒去，拍盡液體；
重復操作4次；
4次洗滌后，輕輕倒拍幾次酶標板，倒放在紙巾上一會兒，吸盡殘液。
——機器洗滌
洗滌液每孔400μl，重復洗滌4次。
6.每孔加入200μl的底物溶液（試劑4a＋4b）。
7.室溫 （不超過+30℃）避光孵育30分鐘。（若室溫高于+30℃，則避光孵育15分鐘。）
8.每孔加入100μl1N終止液。
9.在450nm波長下測定各孔的吸光度值。
結果
結果的計算：
繪制標準曲線，縱坐標為吸光度，橫坐標為標準品的濃度，從標準曲線上讀取質控和標本的濃度。
質量控制值
每批試劑盒的每套試劑盒內都要一張單獨紙片，給出質控的期望值，只有質控測定值在期望值范圍內，結果才能被接受。
期望值和結果說明
對于正常的和假定的陽性之間的區別，是根據一個預定的臨界值。臨界值是根據給定的正常人口hTSH值的參考范圍，憑經驗設定的，高于或接近臨界值的標本建議復試。
性能特點
敏感性 zui小濃度為0.9mIU/L
性
批內分析
批內分析不度
批間分析
批間分析不度
其他腦垂體激素和人絨毛膜促性腺激素干擾實驗
LH FSH HCG 干擾實驗檢測 在含10 mIU/LTSH血清中加入一定數量的每種激素。
膽紅素干擾實驗
在濃度為0.05-10g/l,無干擾現象。
準確性
用CDC質控標本檢測
臨床評估
labsystems公司的臨床評估分別在兩個不同的實驗室。在上海新華醫院隨機抽查 10780名新生兒進行篩查。樣品從剛剛出生三天的小孩采集。正常健康的嬰兒和甲低陽性的嬰兒濃度分布模式圖如下：
10780份新生兒樣品檢測分布圖，預定的臨界值設置為10 mIU/L。此預定值重測率僅為0.41%。
常見錯誤及糾正
低吸收值并且標準曲線很
| 原因 | 糾正 |
| 1試劑變質 *由于污染 *由于儲存不當 | 1當需要從一個試劑瓶中反復移液使用無菌操作技術 2根據說明書所述儲存試劑 |
| 2試劑沒有預熱到室溫 | 用溫度計檢查溫度 |
| 3反應時間過短 | 根據說明書所述進行保溫 |
| 4讀數儀波長設置不正確 | 讀數波長應為450nm |
| 5讀數儀被設置成減去空白 | 重新設置讀數儀 |
高本底
| 原因 | 糾正 |
| 1由于吸液不充分引起的洗板不充分 | 1調節清洗頭 2檢查清洗頭是否被纖維堵塞 |
| 2保溫時間過長 | 根據說明書所述進行保溫 |
| 3保溫溫度過高 | 使用室溫振蕩15分鐘,4℃過夜的方式,底物保溫使用15分鐘. |
低精密性
| 原因 | 糾正 |
| 只有標準曲線不好 | |
| 標準和質控由于不恰當的儲存而變質 | 避免過度陽光和潮濕,將標準和質控同干燥劑密封在錫箔袋中,干燥劑應是藍色的. |
| 整板不好 | |
| 1移液設備未正確校正 | 檢查與校正移液器 |
| 2由于洗頭的污染而導致不正確的洗板 | 經常清潔清洗頭 |
| 3洗板后停留時間過長,板已干燥 | 根據說明書操作 |
| 只有病人樣品不好 | |
| 樣品中血液的不平均分配 | 如果可能,應使用被血液*浸透的樣品 |
操作注意事項
1.仔細閱讀試劑盒使用說明書。
2.開始檢測前，把試劑盒內所有的試劑及酶標板放置+20--+25℃平衡30分鐘。
3.不要使用超過有效期的試劑，不要互用不同批號的試劑，因為每批號試劑的標準品和質控值有可能不同，注意標準品和質控的單位，分清是血清還是全血。
4.建議每塊板都使用標準品和對照。
5.檢測一旦開始，隨后的步驟應連續地進行下去，不要中斷。
6.嚴格操作，方能獲得理想的檢測結果。應準確地使用加液器，不要使加液頭子接觸孔壁，避免孔間污染；配制底物溶液等時，所用的器具必須是潔凈的，仔細地洗板是很重要的。
7.孵育時間的輕微變化是許可的,2小時±10分鐘，20分鐘±5分鐘。
8.TMB顯色劑必須在臨用前配制，TMB顯色劑是溶解在二甲基亞砜中的，二甲基亞砜對眼睛和皮膚有刺激，萬一接觸眼睛應立即用清水沖洗，然后 去醫院治療；接觸皮膚后應立即用大量清水沖洗；操作應帶手套；氧化劑，金屬離子和肥皂殘留物均能干擾TMB的反應。TMB的熔點是18℃，低于此溫度，易 結晶，使用前應放置+18--+25℃平衡溶解后用底物緩沖液稀釋配制。TMB顯色劑是光敏感性的，避免暴露在強光下。
9.清洗玻璃容器時，用1N的酸（HCL和H2SO4）*洗滌，然后用蒸餾水洗滌及遍。
10. 結果一定要以吸光度來判斷，不能憑目測判斷。
11. 本試劑盒應貯存于+2--+8℃。
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