干貨分享 | SNP研究中，你一定遇到過這些問題，附解答！
SNP作為第三代分子標記，其應用非常廣泛，在農業領域中，可以進行性狀基因的精細定位、分子輔助育種、種子資源鑒定等；在醫學領域中，可用于疾病的分子遺傳機制研究、疾病基因定位、藥物敏感或疾病易感性位點篩選等，生命科學研究的方方面面，都與之相關。
SNP的研究主要分為SNP的發現及SNP的基因分型。SNP的發現是應用的基礎，而SNP的基因分型是應用的技術手段。新SNP通常是基于測序技術，利用已有數據庫，對多個樣本進行重測序發現的，但需要進行其他方法的驗證；而已知SNP的基因分型可以通過芯片技術來篩選與表型相關的SNP，從中優選出多態性高，均勻分布的少量SNP，這些少量的SNP可以在大量樣本中進行檢測，根據樣本情況、SNP數量、試驗設計等選擇合適的方法學。前段時間，小編和大家一起了解了SNP分型檢測的幾種常用方法、原理以及在不同領域的應用情況等，近期小編也收集到部分小伙伴關于SNP的問題，整理如下，方便大家進一步對一些細節性問題進行了解哦。
想了解SNP就得先了解什么是DNA的多態性。人與人之間絕大部分的DNA序列是一樣的，DNA的多態性是指正常人群中，DNA分子或基因的某些位點可以發生改變，使DNA的一級結構各不相同，但并不影響基因的表達，形成多態；DNA的多態性可以看作是在分子水平上的個體區別的遺傳標志。DNA多態性主要表現為反應限制性酶切位點變化的限制性片段長度多態性（RFLP）、反應重復單位拷貝數差異的串聯重復序列多態性，以及反應點突變的單核苷酸多態性（SNP）等。
為什么說SNP是二等位基因系統，而不像RFLP和SSR是多等位基因系統？單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，即在群體中，基因組內特定核苷酸位置上存在兩種不同的核苷酸，并且其出現的頻率大于1%。SNP所表現的多態性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換（transition嘧啶和嘧啶之間或者嘌呤和嘌呤之間的交換）或顛換（transversion嘧啶和嘌呤之間的交換）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。SNP 在CG 序列上出現較為頻繁，由于CG 中C 即胞嘧啶常被甲基化，自發脫氨后即變為胸腺嘧啶T，因此大多數情況下，都是發生的C→T的轉換，而變成A和G的概率很小，所以一般認為SNP是二等位的，或者是二態性，即一個堿基只會突變為另一種堿基，而不會同時突變為另外多種堿基。由于SNP的二態性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs只需要＋／－的分析，而不用分析片段的長度，也讓其應用更為廣泛。
SNP是單堿基多態性，是一個群體概念，這個差異占群體的1%以上。若germline mutation頻率<1%，則認為是一個點突變。SNP是各種生物都有的，通過同源基因比對獲得的，一般不會發生變化，而點突變只對單一基因而言，所以從數量上SNP比點突變多得多。如果突變發生在生殖細胞，則可以遺傳，但是只要這個突變群沒有達到總群體的1%，它就只有一個突變株/系，達到了1%就是多態性了。
SNV，即單核苷酸位點變異（single nucleotide variants），SNP，即單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism)，這兩個概念都是指單核苷酸的改變，只不過SNP一般是二態的，而SNV沒有這樣的限制。另外，如果只是在病人體內檢測到單個核苷酸的變異，而其在人群中出現的頻率未知，則可看作SNV。
分子標記（Molecular Markers）是以個體間遺傳物質即核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接反映。根據分子標記檢測的原理、技術手段以及通量效率，一般將分子標記分為三大類，分別是基于分子雜交技術的第一代分子標記、基于PCR技術的第二代分子標記以及基于測序技術的第三代分子標記。不同的分子標記技術如圖1 所示。
最典型的代表類型如限制性片段長度多態性（RFLP），是以Southern雜交為核心設計。限制性片段長度多態性是指同種生物不同個體間DNA 序列產生差異，形成可被限制性內切酶識別的序列進而可被消化，被消化后的產物由于長度不同可通過電泳進行分型，RFLP操作簡單、成本低廉，從而使RFLP被選為人類基因組計劃的第一代遺傳標記，用于基因圖譜繪制、DNA指紋分析、疾病易感性分析、基因診斷、親權鑒定等。包括隨機擴增多態性DNA（random amplified polymorphic DNAs，RAPD），擴增片段長度多態性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、簡單序列重復標記（SSR）等，也有學者僅將微衛星作為第二代分子標記代表，即短串聯重復序列（STR）或簡單重復序列（SSR），一般由2-6個核苷酸組成，是廣泛分布在真核生物基因組中的簡單重復序列。它具有多態性高、穩定可靠等特點，因此是一種十分理想的分子標記，在遺傳圖譜構建、數量性狀位點（QTL）定位、標記輔助選擇、遺傳檢測等領域都有著重要的應用價值。隨著DNA測序技術的發展，以單核苷酸多態性（SNP）為代表的第三代分子標記迅速發展成為主流，SNP在所有生物的基因組中含量豐富，突變率較低，且獲取的成本低，因此被廣泛用于遺傳多樣性、系統發育分析和遺傳和疾病相關基因的研究中。第1-3代分子標記中幾種代表性的標記類型的特點如表1所示。
表1.第1-3代標記中幾種代表性的DNA分子標記的特點
具有高的多態性，較高的多態水平和樣本量，有利于在試驗中檢測出個體間的差異，差異性越大，越能體現出優勢基因和優勢基因型；
共顯性遺傳，即利用分子標記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；
除特殊位點的標記外，要求分子標記均勻分布于整個基因組；
容易獲得且可快速分析，檢測手段便于實現自動化；
開發成本和使用成本盡量低廉；
在實驗室內和實驗室間重復性好（便于數據交換）。
SNP在基因組內的形式有哪些，都會對生物表型有影響嗎？在基因組DNA中，任何堿基均有可能發生變異，因此SNP既有可能在基因序列內，也有可能在基因以外的非編碼序列上。總的來說，有三類：位于基因周邊的SNPs(pSNPs)，位于基因間的SNPs(iSNPs)，以及位于編碼區內的SNP(codingSNP，cSNP)。
位于編碼區內的SNP（cSNP）比較少，但由于它發生在編碼區內，在遺傳性疾病研究中具有重要意義，因此cSNP的研究更受關注。從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種：一種是同義cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP（non-synonymous cSNP），指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列發生改變，從而影響了蛋白質的功能。這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。
位于非編碼區域的SNP又可細分為兩類，內含子中SNP對個基因功能的影響相對較小，主要依靠影響剪切位點活性來影響翻譯，從而基因功能。而基因調控區域包含啟動子區域、增強子區域等等，這些區域含有很多基因表達調控元件，這些位點的SNP發生變化，就會導致與調控因子的結合能力發生改變，從而影響正常的基因表達。
由美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）建立、dbSNP 數據庫制定的 SNP 命名體系，rs 體系的 SNP 代表已獲得認可和推薦的參考 SNP（reference SNP），ss 體系的 SNP 代表用戶新遞交但尚未得到認可的 SNP（submitted SNP）。對于新發現的SNP位點，需要判斷這些SNP位點是否已知。如果該SNP位點是前人報道，需要查找rs號和引用參考文獻，如果為新發現的位點則需要將該位點遞交到NCBI上，獲得ss號。
SNPedia是一個SNP百科全書類網站，它引用已經發布的文章或者數據庫信息，對SNP位點進行描述，共享著人類基因組變異的信息。我們可以搜索某個SNP位點來尋找與之相關的信息，也可以根據相關疾病和癥狀來尋找相關的SNP（圖2）。
圖2.SNPedia首頁
- 如果是單基因遺傳，特別是罕見遺傳的疾病，可以通過外顯子測序對一個家系的幾個個體進行測序，篩選低頻突變，隨后找到能改變蛋白功能的突變，最后做共分離分析。
- 如果是多基因病或者質量性狀定位，那么2個方法，一是全基因組關聯分析GWAS，用散發型個體，進行關聯分析，不過這種方法要的樣本量比較大，一般都要好幾百至好幾千個樣本。二是基因家系的連鎖分析，這個主要是定位，然后在后續做一些東西，一般用芯片或者全基因組重測序或者簡化基因組測序。
- 通過參考資料鎖定研究相關的基因，通過數據庫查到基因內部的 SNP 位點。
- 查找相關的參考文獻，找到研究相關的 SNP 位點。
進行SNP位點驗證，采用對照組和實驗組的大量樣本，驗證目標SNP位點SNaPshot 法：基于多重PCR和ABI 3730xl 測序平臺的 SNP 分型檢測；
直接測序法：基于一代測序平臺的SNP分型檢測；
質譜法：基于Sequenom平臺的SNP分型檢測；
Taqman探針法：基于熒光定量PCR儀平臺的SNP分型檢測，等等。
根據已有的對照組和實驗組的SNP分型結果與實驗目的進行關聯分析，如與疾病的關聯分析、遺傳連鎖分析、品種鑒定等ARMS PCR是基于Taq DNA聚合酶無法修復引物3’末端的單個堿基錯配，從而使得擴增受阻的檢測方法。該方法理論上單個堿基的錯配即可阻礙PCR的擴增，但在實際檢測時，單個堿基的錯配依然可以延伸擴增，只是效率較低。為了提高其特異性，有時需在3’末端倒數第2位或第3位堿基處引入一個錯配堿基，該錯配堿基與3’末端的錯配堿基共同作用，以降低非靶標序列的擴增效率。而如何設計錯配堿基可參考如下標準（圖3）：1）當3’末端是“強”錯配時（A/G或G/T）時，可以在引物中引入一個“弱”錯配（C/A或C/T）；2）當末端是“弱”錯配時，則需要在引物中引入一個“強”錯配；3）當末端是“中”錯配時（A/A，C/C，G/G，T/T）時，可以在引物中再引入一個“中”錯配。一般在3’末端倒數第三個堿基引入突變，可顯著提高特異性。
雖然有以上強弱錯配進行搭配的參考原則，但在實際產品開發過程中，小編還是建議把所有堿基錯配類型全部嘗試一遍，如引入錯配位置模板為C堿基，則可考慮設計A/C、T/C、C/C三種錯配進行篩選。此外理論上，3′端倒數第2或第3位錯配篩選到合適引物的概率最高，但假如這兩個位置效果都不理想，可嘗試3′端倒數第4、5位，甚至是倒數第7位。如果從3′端倒數第2位至倒數第7位全部篩選，總共要篩選18條引物，引物的條數是比較多的，但是確實位置不同可能效果也不同，具體什么位置無法保證，只能靠驗證結果來決定啦。
翌圣生物作為上游原料企業，在分子酶領域深耕多年，目前已開發了ARMS-PCR法及TaqMan探針法的SNP分型檢測通用原料，已被下游廠家應用于腫瘤伴隨診斷、藥物基因組學、遺傳病檢測、疾病易感性研究等多個領域。
手機版
化工儀器網手機版
化工儀器網小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關注視頻號
采購中心