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核酸中的蛋白質(zhì)污染鑒定難度大
苯酚-氯仿法是核酸提取的經(jīng)典方法，卻極易在回收水相中的核酸時引入蛋白污染。這將導致：
1 A260讀數(shù)偏高（核酸在260nm處有吸收），計算核酸濃度偏大；
2 污染蛋白通過抑制或干擾酶促反應，影響下游的RT-PCR及qPCR結(jié)果，但是由于蛋白質(zhì)的消光系數(shù)遠小于核酸的消光系數(shù)(蛋白中色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、半 胱氨酸的二硫鍵在280nm處有吸收)，因此需要蛋白質(zhì)濃度達到較高的水平才能在A260/A280的比值上體現(xiàn)出來(Glasel,1995,Hubeman,1995,and Manchester,1995)1-3，這給核酸中的蛋白質(zhì)污染鑒定帶來很大難度。
解決方案
針對這一難點，NanoDrop One/OneC和NanoDrop Eight超微量分光光度計內(nèi)置了Acclaro智能污染物分析系統(tǒng)，能夠基于光譜數(shù)據(jù)庫和算法準確識別、鑒定出待測樣品中的污染物質(zhì)，并實時給出校正后樣品真實濃度（見下圖1）。今天我們通過實驗解析蛋白污染對核酸樣品純度、定量的影響，以及NanoDrop One是如何準確識別此類污染，并給與準確校正的。
下圖1 Acclaro智能污染物識別功能提示
樣品中可能存在的污染物
1a) 檢測結(jié)束之后，在濃度前會顯示黃色三角形，提示在此dsDNA樣本中檢測到污染物
1b) 吸光度光譜圖中，藍色表示原始光譜(DNA加污染物)、綠色表示修正后光譜(DNA減污染物)、黃色標識污染物光譜，右上角給出包括校正前后的樣品濃度A260/A280、A260/A230比值和存在的污染物及類型
實驗過程
將dsDNA標準品（鮭魚精子DNA溶液）和蛋白樣品（BSA溶液）按照不同比例混合得到九組混合物（見表1）。使用NanoDrop One分別測量九組混合物dsDNA濃度，每組溶液均重復測量五次，計算平均濃度和標準偏差(SD)（結(jié)果見表2）。
表1 不同量的DNA 和蛋白原液混合比例
表2 NanoDrop One 測量混合物中DNA濃度
表2中，The original（uncorrected）DNA 濃度是NanoDrop One直接測出的數(shù)據(jù)，The corrected DNA濃度（混合物5–9）是NanoDrop One Acclaro軟件分析并校正后的數(shù)據(jù)。（注：混合物1-4由于污染蛋白濃度過低，不足以觸發(fā)Acclaro軟件的分析校正功能，因此使用Thermo Scientific™ TQ Analyst™ software package來做光譜分析完成數(shù)據(jù)校正。)
實驗結(jié)果
觀察該表中original DNA濃度數(shù)值及純度比值，可以看出蛋白污染對核酸樣品濃度的影響規(guī)律：
1 不同程度的蛋白污染，都會導致核酸濃度虛高。且污染蛋白含量越高，核酸的測量值和真實值偏差越大。
2 足夠高的蛋白含量才能夠引起260/280純度比值的顯著變化。本例中污染蛋白比例占到近72%時，A260/A280純度比值為1.74，仍處于可接受范圍內(nèi)。當污染水平從72%增加到98%時，A260/A280純度比值才從1.74穩(wěn)步降至0.89。
同時，從該表中corrected DNA濃度以及黃色警示標識表示可以看出NanoDrop One的污染物校正功能特點：
1 能夠準確識別并且定量核酸樣品中的蛋白污染，超出一般實驗可接受范圍時給與警示符號提示。
2 使用Acclaro軟件，校正后的核酸濃度與真實值的偏差控制在10%范圍內(nèi)。即使對于98%的蛋白污染濃度，Acclaro給出的校準值依然在此范圍內(nèi)，且具有高度可重復性。
表3 所有混合物的校正濃度均在實際DNA濃度的10％以內(nèi)
NanoDrop One/OneC和NanoDrop Eight內(nèi)置的Acclaro智能污染物分析系統(tǒng)提供了一種全新的計量學方法，幫助研究人員：
-
確定樣本中的污染物類型；
-
確定污染物濃度；
-
獲得校正后的核酸濃度；
極大的降低了核酸質(zhì)控的難度，節(jié)約了時間成本、減少了耗材浪費。
基因有限公司簡介
基因有限公司作為Thermo的忠實合作伙伴，在國內(nèi)推廣NanoDrop產(chǎn)品線近20年，在全國19個大中城市設(shè)有辦事處或者聯(lián)絡(luò)點，接下來也將會一如既往地繼續(xù)為廣大客戶提供包括NanoDrop在內(nèi)的產(chǎn)品售前咨詢、售后支持和儀器維護維修等優(yōu)質(zhì)服務。
參考文獻
1. Glasel, J.A. 1995. Validity of nucleic acid purities monitored by 260 nm/280 nm absorbance ratios. Biotechniques 18:62–63.
2. Huberman, J.A. 1995. Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240 nm as well as at 260 nm and 280 nm.Biotechniques 18:636.
3. Manchester, K.L. 1995. Value of A260/A280 Ratios for the Measurement of Purity of Nucleic Acids. Biotechniques 19:208-210.
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