“clean meat”作為日益增長的全球人口的膳食蛋白質替代來源，它的成功商業化將需要開發高效、廉價的無血清細胞培養基。與基于血清的培養基相比，無血清培養基引發不同的細胞生長行為，但全面探索無血清培養對培養肉相關細胞類型的營養需求的影響的數據尚未報道。Edward N. O’Neill等人對在Essential 8無血清培養基和常規含血清培養基中培養的C2C12細胞和培養基成分進行了分析。

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實驗前細胞的制備：

細胞：C2C12細胞；

培養基：40%的DMEM、40%的Ham’s F10、20%的FBS和另外的2.5ng/mL重組人堿性成纖維細胞生長因子；

培養方式：將細胞維持在組織培養物處理的（TC）聚苯乙烯培養皿上，以5000個細胞/cm²接種，并使用Try-pLE Express在達到約75%匯合時傳代。使用臺盼藍法通過血細胞儀進行計數；

培養條件：37°C和5%CO₂。

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實驗方法：

將TC處理的聚苯乙烯六孔板用Matrigel涂布，使用0.15mg/mL蛋白質的稀釋溶液進行常規薄涂布。將P10的C2C12細胞重懸于無血清Essential 8或PCGM培養基中，并以10⁵個細胞/孔接種，總體積為每孔3mL培養基。此后不久，將2μL Hoechst 33342核染色劑的濃縮儲備溶液加入每個孔中，使孔中的最終濃度為0.2μg/mL。細胞接種后，將6孔板不受干擾地留在細胞培養箱中。在觀察時間點，使用ImageXpress Pico高含量篩選顯微鏡系統對來自兩個培養基組的三個重復孔的協同反應組進行成像。

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檢測方法：

1.     葡萄糖、乳酸：HP 1100高效液相色譜（HPLC）系統與折射率（RI）檢測器結合使用Aminex HPX-87H柱。

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2.     氨基酸：使用REBEL分析儀（908 Devices）測量新鮮培養基和廢培養基中的氨基酸濃度。使用0.20μm無菌過濾器制備樣品以去除細胞碎片，然后使用REBEL稀釋劑稀釋。通過微流體毛細管電泳和高壓質譜（CE-HPMS）對每個樣品進行一式三份的分析。根據遷移時間和質量自動識別分析物。

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3.     FGF2：使用人FGF2的酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒。使用SpectraMax iD3多模平板讀取器在450nm處讀取96孔測定板中的最終比色吸光度。

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實驗結果：

1.     細胞密度：通過在培養過程中每24小時記錄一次每孔的細胞密度（圖1），確定與傳統含血清培養基相比，無血清E8培養基支持類似程度的細胞生長。E8細胞計數在第3天呈指數級增加，并更快地達到其最大值（高于PCGM培養基中的任何時間的細胞密度），但隨后開始輕微下降，然后在第6天后顯著下降（可能是由于細胞死亡和脫落增加）。PCGM細胞密度在第2天結束指數增長，但繼續逐漸增加到第7天。

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圖1 細胞密度的變化

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2.葡萄糖和乳酸濃度：數據（圖2A和2B）表明，葡萄糖在兩個培養基組之間的使用非常相似，直到第4天左右，盡管PCGM組中細胞持續生長，E8組中細胞數量減少，但PCGM的使用減慢，但E8的使用仍在繼續。雖然PCGM中的初始乳酸鹽濃度顯著高于E8，但在七天的培養期內，兩種培養基中乳酸鹽積累的相對速率相似。

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3.FGF2的濃度：E8中的額外FGF2被用作旨在取代FBS功能的主要成分。數據（圖2C）表明，在培養的3或4天左右，兩種培養基中的FGF2濃度開始顯著降低，這大致是相應細胞密度停止指數增長的時間。雖然在兩種培養基類型的培養中，FGF2濃度在約5或6天時達到其最小可測量值，但此后細胞密度維持了至少幾天。總體而言，兩種介質類型之間的相對FGF2消耗模式沒有顯著差異。

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4.氨基酸濃度：（圖2E）PCGM和E8之間每種氨基酸的大多數初始（D0）濃度相似，與它們的基礎培養基配方一致。差異可能是由于PCGM中FBS成分的未知氨基酸圖譜造成的。對于任何一種培養基，許多氨基酸濃度都沒有隨著時間的推移而顯著降低，這表明它們沒有被使用或被細胞代謝循環。對于一些氨基酸，E8培養基組似乎消耗的與PCGM中的細胞相比更快。例如，與PCGM中的谷氨酰胺和甘氨酸濃度相比，在培養的第4–5天，E8中谷氨酰胺和甘氨酸的消耗量顯著增加。到第3天左右，E8中絲氨酸幾乎耗盡，這是指數生長停止的時間。除此之外，除了精氨酸等少數氨基酸外，大多數氨基酸的利用總體趨勢相似。

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圖2 葡萄糖、乳酸、FGF2、氨基酸濃度的變化

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實驗結論：

結果表明，C2C12成肌細胞系在E8中的表現至少與含血清培養基同樣好（圖1）。C2C12是一種永生化肌肉細胞系，在重要生理方面與成人干細胞不同，成人干細胞可能與Clean Meat更相關。因而，為了達到更好的加工效率，Clean Meat行業可能需要開發自己的永生化細胞系，如C2C12。然而，來自不同物種和譜系的Clean Meat相關細胞的培養基需求之間存在顯著差異，針對每種細胞類型摸索、優化培養基成分是必要的。

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該實驗對葡萄糖和乳酸濃度動力學的檢查（圖2A和B）展示了培養基類型對細胞代謝行為的有趣影響。有血清和無血清培養基的葡萄糖利用率和乳酸積累基本相似，表明細胞在不同培養基中的代謝活性沒有顯著差異，并表明無血清培養基可能不會直接影響葡萄糖代謝。然而，血清中存在的許多額外生長因子、細胞因子和其他信號分子中的一些的復雜相互作用可能也值得進一步研究。

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氨基酸動力學分析（圖2E）表明，許多氨基酸不會被生長在含血清或無血清培養基中的細胞顯著消耗，因此可能不必包含在優化的Clean Meat培養基中，或者至少不需要包含如此大量的氨基酸。然而，實驗結果也揭示了在兩種類型的培養基中生長的細胞的氨基酸代謝之間的有趣差異。谷氨酰胺利用率的差異表明E8培養基中的細胞正在經歷更高的谷氨酰胺裂解率，直到谷氨酰胺在第4天左右耗盡；E8中天冬氨酸和丙氨酸（谷氨酰胺分解的代謝產物）直到第4天的低消耗率支持了這一觀點。血清與無血清培養基之間氨基酸代謝的的生化差異很有趣，值得進一步探索。

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雖然兩種培養基之間的總體FGF2利用趨勢沒有顯著差異。與PCGM相比，在無血清E8培養基中生長的細胞更多地利用FGF2，這可能是由于缺乏血清中常見的其他生長促進因子，使得FGF2作為SFM中生長的“底物”比其他情況下更重要。E8培養液中的FGF2越多，E8中獲得的總細胞數越高。然而，這種程度的增長是否決定了Clean Meat培養基中需要高水平的昂貴的生長因子仍然是一個懸而未決的問題。

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表征大多數Clean Meat相關細胞類型的代謝需求方面完成的工作相對較少，因此對它們做出的許多更具體的代謝假設都源于對這些細胞類型在早期研究中如何表現的了解，而這些研究通常都使用含血清的培養基。這些假設可能不利于將細胞轉化為無血清和化學定義的培養基的總體容易性和成功性。為各種細胞類型適當優化無血清培養基，以成本實現Clean Meat生物工藝，可能需要大量的時間和精力。也許，可以創建Clean Meat的細胞系，從而實現更大的多功能性，這可能是研究Clean Meat細胞/工藝的實驗人員未來值得追求的目標。

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