2023年2月8日，俄亥俄州立大學(xué)董一州團(tuán)隊(duì)在Advanced Science發(fā)表了一篇LNP成功遞送saRNA至精母細(xì)胞治療小鼠不育的文章——Cholesterol-Amino-Phosphate (CAP) Derived Lipid Nanoparticles for Delivery of Self-Amplifying RNA and Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice。
 
基因突變引起的男性不育癥是不育癥的重要類型。目前，臨床上還沒有可靠的方法來解決這種醫(yī)療需求。mRNA療法的出現(xiàn)為修復(fù)生殖系統(tǒng)中的突變基因提供了一種可能的策略。然而，將mRNA有效遞送至精母細(xì)胞仍然是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。因此，研究團(tuán)隊(duì)希望開發(fā)一種新的LNP可以將saRNA有效遞送至精母細(xì)胞，用于治療男性不育癥。

一、CAP LNP的合成、配方和表征
為了增強(qiáng)mRNA遞送進(jìn)入精子細(xì)胞，在生物膜和男性生殖系統(tǒng)起到關(guān)鍵作用的一些生物活性分子引起研究人員的關(guān)注。例如，膽固醇是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分，維持細(xì)胞膜的完整性和通透性。先前有研究報(bào)道在精子生成過程中膽固醇水平會(huì)升高，這表明膽固醇代謝與生育能力之間存在密切關(guān)系。此外，磷酸基團(tuán)是磷脂的極性部分，同時(shí)也是是生物膜的關(guān)鍵組成部分，參與細(xì)胞運(yùn)輸途徑。最后，氨基可以電離變?yōu)檎娦缘模c帶負(fù)電的mRNA相互作用。除了生物活性之外，可電離的脂質(zhì)的幾何結(jié)構(gòu)，可以用包封參數(shù)（P值）來描述，會(huì)極大地影響 LNPs的傳遞效率。通常，P 值大的脂質(zhì)有利于形成倒錐形，有利于內(nèi)體膜的倒六邊形（HII 相）轉(zhuǎn)變和遞送貨物的內(nèi)體逃逸。
為了實(shí)現(xiàn) LNPs 將編碼功能蛋白的 mRNA 遞送進(jìn)精母細(xì)胞中，恢復(fù)精子生成的目標(biāo)，他們整合了3個(gè)生物活性分子單元，設(shè)計(jì)一系列膽固醇-氨基-磷酸酯（CAP）脂質(zhì)，配制成CAP LNPs。CAP LNP 由CAP、DOPE、DMG-PEG和編碼Dmc1的mRNA配制而成。在顯微注射到曲細(xì)精管后，CAP LNP將Dmc1 mRNA遞送到精母細(xì)胞，從而恢復(fù)染色體重組和精子發(fā)生。

 
圖1 使用CAP LNP遞送編碼Dmc1的 mRNA 的示意圖

首先，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一條 CAP 衍生物的合成路線（圖 2a），并進(jìn)一步表征了它們的理化性質(zhì)，最終選擇了CAP2-4 LNPs進(jìn)行后續(xù)研究。研究者應(yīng)用 CAP2-4 LNP 在Dmc1 -/-小鼠模型中遞送綠色熒光蛋白(GFP) mRNA，24小時(shí)后分析 GFP 的表達(dá)。如圖 2e所示，CAP2-4 LNPs 在曲細(xì)精管周圍誘導(dǎo)出明顯的綠色熒光，而 MC3 LNPs 和 ALC-0315 LNPs 組中幾乎檢測(cè)不到 GFP 信號(hào)。這些結(jié)果證明 CAP2-4 LNPs 是精母細(xì)胞中 mRNA 遞送的優(yōu)良載體，遞送效率明顯高于 MC3 和 ALC-0315 LNPs。

 
圖2 CAP 脂質(zhì)的合成方法、3D結(jié)構(gòu)以及在生精小管中的遞送效率比較

二、CAP LNP可將saRNA遞送至Dmc1-/-小鼠模型中的精母細(xì)胞
接下來，作者比較了傳統(tǒng) mRNA和saRNA 之間 Dmc1 蛋白的表達(dá)時(shí)程。他們將帶有 Flag 標(biāo)簽的 Dmc1 mRNA 或 saRNA 封裝到CAP2-4 LNP 中，并將兩種制劑注射到 Dmc1-/-小鼠的曲細(xì)精管中。給藥后24和72小時(shí)，通過免疫熒光染色評(píng)估曲細(xì)精管中 Dmc1 的表達(dá)。如圖3a所示，在CAP2-4 LNP-mRNA和CAP2-4 LNP-saRNA 處理的小鼠中24小時(shí)均觀察到明顯的 Dmc1 表達(dá)，但在未處理的小鼠中則沒有。CAP2-4 LNP-mRNA給藥72小時(shí)后，曲細(xì)精管中幾乎沒有熒光信號(hào)（圖3b）。相反，CAP2-4 LNP-saRNA處理組仍然顯示出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)（圖3b）。這些結(jié)果表明，通過 CAP2-4 LNP 遞送 saRNA 可以維持 Dmc1 蛋白表達(dá)至少三天。

圖3 在 Dmc1-/-小鼠中遞送編碼 Dmc1蛋白的傳統(tǒng)mRNA或saRNA

三、使用CAP LNP遞送saRNA恢復(fù)Dmc1蛋白功能
隨后，作者通過分析聯(lián)會(huì)復(fù)合體 (SC)來檢查 Dmc1 蛋白的功能。SC 是在減數(shù)分裂 I 期間形成的特定結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)同源染色體的聯(lián)會(huì)。由于 Dmc1 缺陷可破壞 SC 形成并阻止減數(shù)分裂 I 后期的精子發(fā)生，因此 SC 被認(rèn)為是 Dmc1 蛋白功能恢復(fù)的關(guān)鍵指標(biāo)。Dmc1-/-小鼠用 CAP2-4 LNP-saRNA 處理，處理后第 4天，收集睪丸。通過 SYCP1 和 SYCP3（參與 SC 形成的兩個(gè)主要成分）的免疫熒光染色檢查精母細(xì)胞中的 SC。如圖4a所示, SYCP3和SYCP1染色清楚地顯示了 WT 小鼠的五個(gè)亞階段的特征模式，包括細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期、終變期。在CAP2-4 LNP-saRNA 處理組中，我們觀察到處于粗線期的SC，這表明同源染色體聯(lián)會(huì)的恢復(fù)。此外，對(duì)SC在雙線期和終變期的觀察進(jìn)一步證實(shí)了SC可以解體并轉(zhuǎn)運(yùn)到中期（圖4b）。相反，來自 Dmc1-/-小鼠的 SC 在前期的早期階段被阻滯，并且未觀察到粗線期、雙線期和終變期的 SC（圖4c）。如圖4d所示，在 CAP2-4 LNP-saRNA 處理后，粗線期、雙線期和終變期精母細(xì)胞的百分比分別增加到 11%、6% 和 2%。總的來說，這些結(jié)果表明使用 CAP LNP 遞送 saRNA 可恢復(fù)精母細(xì)胞中 Dmc1 蛋白的功能。

 
圖4 使用CAP LNP遞送saRNA可恢復(fù)Dmc1-/-小鼠中的Dmc1功能

四、CAP LNP-saRNA 挽救 Dmc1-/-小鼠的精子發(fā)生
最后，作者研究了通過 CAP2-4 LNP-saRNA 恢復(fù) Dmc1 蛋白是否可以挽救 Dmc1-/-小鼠的不育癥。Dmc1-/-小鼠用 CAP2-4 LNP-saRNA 處理。處理后第10天，收集睪丸和附睪。睪丸和附睪切片用花生凝集素 (PNA)染色，它可以特異性結(jié)合精子細(xì)胞頂體（圖5a）。PNA 染色的精子細(xì)胞位于 WT 小鼠的曲細(xì)精管和附睪管中。然而，Dmc1-/-小鼠的睪丸和附睪中沒有細(xì)胞被 PNA-凝集素染色，表明精子細(xì)胞生產(chǎn)全喪失。相比之下，我們?cè)?CAP2-4 LNP-saRNA 治療組的曲細(xì)精管和附睪管中觀察到了 PNA染色的細(xì)胞，這是挽救 Dmc1-/- 小鼠不育表型的直接證據(jù)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，治療組每根小管的PNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于未治療組，達(dá)到WT組的二分之一左右（圖5b）。因此，這些結(jié)果證明，使用 CAP LNP 遞送 saRNA可以有效挽救 Dmc1-/-小鼠中的精子細(xì)胞產(chǎn)生。
此外，對(duì)睪丸樣本進(jìn)行組織學(xué)分析以評(píng)估生精發(fā)育。如圖5c所示，WT 小鼠表現(xiàn)出正常的睪丸形態(tài)，而 Dmc1-/-小鼠在精母細(xì)胞階段表現(xiàn)出精子發(fā)生停滯并且缺乏減數(shù)分裂后細(xì)胞。與 WT 小鼠相比，Dmc1-/-小鼠的生發(fā)層厚度和生精管直徑顯著降低（圖5d，e）。相比之下，CAP2-4 LNP-saRNA 重建了 Dmc1-/-小鼠的睪丸形態(tài)，增加了生發(fā)層厚度和生精管直徑（圖5d，e)。精子懸液細(xì)胞學(xué)涂片顯示，CAP2-4 LNP-saRNA處理組的附睪產(chǎn)生橢圓頭單尾不卷曲的精子，而未處理組未觀察到精子樣細(xì)胞（圖 5f）。

 
圖5 使用 CAP LNP 遞送saRNA可挽救 Dmc1 -/-小鼠的不育表型

總的來說，這項(xiàng)研究利用 CAP LNPs 可以向精母細(xì)胞傳遞 mRNA，證明基于mRNA療法在治療由基因突變引起的男性生殖疾病方面的可行性。

Absin擁有成熟的mRNA制備及LNP包裹技術(shù)：

線性mRNA定制流程：

環(huán)狀RNA定制流程：

標(biāo)準(zhǔn)臨床概念驗(yàn)證方案流程：
標(biāo)準(zhǔn)臨床概念驗(yàn)證方案是我司新推出的專項(xiàng)服務(wù)，可以同時(shí)匹配mRNA線性/環(huán)狀技術(shù)，協(xié)助快速推進(jìn)靶點(diǎn)的概念驗(yàn)證，推進(jìn)不同構(gòu)型的mRNA技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上獲得藥效學(xué)結(jié)果，以期能夠快速進(jìn)入轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的級(jí)別。

參考文獻(xiàn)：
【1】 Du S, Li W, Zhang Y, et al. Cholesterol-Amino-Phosphate (CAP) Derived Lipid Nanoparticles for Delivery of Self-Amplifying RNA and Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice. Adv Sci (Weinh). 2023 Feb 7:e2300188.