AO/PI雙染試劑盒說明書

一、產(chǎn)品簡介及特點：

AO/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒是采用AO/PI探針雙染細胞核的方法檢測凋亡細胞的狀態(tài)，是細胞凋亡形態(tài)學研究常用的染色方法。

叩啶橙(Acridine Orange，AO）為一種具有細胞膜通透性的熒光染料，該染料能透過活細胞膜，使核DNA和RNA染色。它與細胞中 DNA和RNA結合量存在差別，復合物可發(fā)出不同顏色的熒光，AO 與dsDNA結合時發(fā)出綠色熒光，而與ssDNA和RNA結合時發(fā)出紅色熒光。當與 DNA結合時，它與熒光素在光譜上非常相似，激發(fā)最大值為502nm，發(fā)射最大值為525nm(綠色)。當它與RNA結合時，激發(fā)最大值移至460nm（(藍色)，發(fā)射最大值移至650nm(紅色)。

在熒光顯微鏡下觀察，葉啶橙可透過正常細胞膜，使細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光;而在凋亡細胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片斷，形成凋亡小體。叫啶橙使其染上致密濃染的黃綠色熒光，或黃綠色碎片顆粒;而壞死細胞黃熒光減弱甚至消失。

Propidium lodide是一種 DNA結合性染料，其激發(fā)和發(fā)射波長分別為488nm和630nm,產(chǎn)生紅色熒光，但無膜通透性，不能透過活細胞膜，只能染死細胞。因此，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞不能著色，早期凋亡細胞呈微弱紅光，晚期凋亡細胞紅光加強，壞死細胞呈強紅色熒光。

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二、產(chǎn)品組成：

三、自備材料：

1、熒光顯微鏡、激光共聚焦、流式細胞儀、離心機、移液器、冰箱、冰盒

2、PBS緩沖液(pH7.4，實驗室常用的10mM磷酸緩沖鹽溶液（1X）)

3、離心管、吸頭、一次性手套

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四、操作步驟(僅供參考)：

染色工作液配制:

1．根據(jù)樣品數(shù)，按下列比例配制染色緩沖液。取100 uL試劑C用900 uL純水稀釋，充分混勻即成染色緩沖液。

2．每500 uL染色緩沖液加入5 uL AO染色液和10 uL PI染色液，充分混勻，即成染色工作液。

【注】:不同細胞樣本的染色濃度和時間有差異，可以根據(jù)預實驗結果調(diào)整染液濃度。以上條件適合大多數(shù)細胞樣本。

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懸浮細胞染色

1. 收集樣本細胞，細胞數(shù)量在10X105個以內(nèi)。

2. 用PBS洗滌細胞兩次。

3. 用500 uL染色工作液將細胞重懸。

4. 輕輕混勻后4℃避光孵育10-20分鐘。

5. 用PBS洗滌細胞。

6. 用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測結果。

貼壁細胞原位染色;

1. 用PBS洗滌細胞2次。

【注】:注意洗細胞過程不要丟失細胞，需要離心收集漂浮細胞。

2. 細胞培養(yǎng)板中或細胞爬片上加入適量體積的染色工作液。

3. 37℃孵育細胞10～30分鐘，不同的細胞最佳培養(yǎng)時間不同。可以用20分鐘作為起始孵育時間，之后優(yōu)化體系以得到均一的標記結果。

【注】:若染色不夠充分，建議增加染料濃度或延長染色時間。

4. 吸干染色工作液，用培養(yǎng)基洗培養(yǎng)板或蓋玻片2~3次，每次用預熱的培養(yǎng)基覆蓋所有細胞，然后吸干培養(yǎng)基。

結果分析:

在熒光顯微鏡下，選用488 nm激發(fā)光鏡檢:

AO染色正常細胞DNA呈均勻黃色或黃綠色，形態(tài)結構正常。

當細胞凋亡時，染色質(zhì)濃縮，細胞核碎裂成點狀，被染成大小不一、致密濃染。壞死細胞呈強紅色熒光。

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五、注意事項：

1、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

2、細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

3、本染色試劑盒可用于細胞、細胞涂片等。以下以懸浮培養(yǎng)細胞的熒光顯微鏡檢測為例，其他方法請參閱相關資料。

4、貼壁細胞可以消化下來染色，也可以直接原位染色。

5、所有細胞都染成了紅色和綠色，沒法區(qū)分活細胞和死細胞?

AO/PI染色是一種凋亡形態(tài)學的染色方法,需要染色后結合核酸的形態(tài)變化進行分析，不是通過顏色差異進行細胞類型的區(qū)分。

AO染色是既有綠色也有紅色的，它與細胞中DNA和 RNA結合量存在差別，復合物可發(fā)出不同顏色的熒光。AO 與dsDNA 結合時發(fā)出綠色熒光，而與 ssDNA和RNA結合時發(fā)出紅色熒光。

染色后觀察核酸的形態(tài)，正常細胞DNA呈均勻黃色或黃綠色，形態(tài)結構正常。當細胞凋亡時，核染色質(zhì)濃縮，細胞核碎裂成點狀，被染成大小不一、致密濃染。壞死細胞呈強紅色熒光。

凋亡細胞出現(xiàn)細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離，細胞質(zhì)密度增加，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為小片段，形成凋亡小體。

六、有效期：2-8 ℃避光有效期為半年

        注：拆封后請盡快使用，有效期為試劑盒未拆封前按要求條件保存的有效期。

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