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AO/PI雙染試劑盒說明書

來源:上海雅吉生物科技有限公司   2023年05月19日 11:18  


AO/PI雙染試劑盒說明書

 

一、產品簡介及特點:

AO/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒是采用AO/PI探針雙染細胞核的方法檢測凋亡細胞的狀態,是細胞凋亡形態學研究常用的染色方法。

叩啶橙(Acridine Orange,AO)為一種具有細胞膜通透性的熒光染料,該染料能透過活細胞膜,使核DNA和RNA染色。它與細胞中 DNA和RNA結合量存在差別,復合物可發出不同顏色的熒光,AO 與dsDNA結合時發出綠色熒光,而與ssDNA和RNA結合時發出紅色熒光。當與 DNA結合時,它與熒光素在光譜上非常相似,激發最大值為502nm,發射最大值為525nm(綠色)。當它與RNA結合時,激發最大值移至460nm((藍色),發射最大值移至650nm(紅色)。

在熒光顯微鏡下觀察,葉啶橙可透過正常細胞膜,使細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光;而在凋亡細胞中,因染色質固縮或斷裂為大小不等的片斷,形成凋亡小體。叫啶橙使其染上致密濃染的黃綠色熒光,或黃綠色碎片顆粒;而壞死細胞黃熒光減弱甚至消失。

Propidium lodide是一種 DNA結合性染料,其激發和發射波長分別為488nm和630nm,產生紅色熒光,但無膜通透性,不能透過活細胞膜,只能染死細胞。因此,在熒光顯微鏡下觀察,正常細胞不能著色,早期凋亡細胞呈微弱紅光,晚期凋亡細胞紅光加強,壞死細胞呈強紅色熒光。

AO/PI雙染試劑盒說明書

二、產品組成:

名稱規格

50T

組份A:AO染色液

500μl

組份B:PI染色液

1000μl

組份C:試劑C

10 ml

 

三、自備材料:

1、熒光顯微鏡、激光共聚焦、流式細胞儀、離心機、移液器、冰箱、冰盒

2、PBS緩沖液(pH7.4,實驗室常用的10mM磷酸緩沖鹽溶液(1X)

3、離心管、吸頭、一次性手套

 AO/PI雙染試劑盒說明書

四、操作步驟(僅供參考)

染色工作液配制:

1.根據樣品數,按下列比例配制染色緩沖液。取100 uL試劑C用900 uL純水稀釋,充分混勻即成染色緩沖液。

2.每500 uL染色緩沖液加入5 uL AO染色液和10 uL PI染色液,充分混勻,即成染色工作液。

【注】:不同細胞樣本的染色濃度和時間有差異,可以根據預實驗結果調整染液濃度。以上條件適合大多數細胞樣本。

 

 AO/PI雙染試劑盒說明書

懸浮細胞染色

1. 收集樣本細胞,細胞數量在10X105個以內。

2. PBS洗滌細胞兩次。

3. 500 uL染色工作液將細胞重懸。

4. 輕輕混勻后4℃避光孵育10-20分鐘。

5. PBS洗滌細胞。

6. 用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測結果。

貼壁細胞原位染色;

1. PBS洗滌細胞2次。

【注】:注意洗細胞過程不要丟失細胞,需要離心收集漂浮細胞。

2. 細胞培養板中或細胞爬片上加入適量體積的染色工作液。

3. 37℃孵育細胞10~30分鐘,不同的細胞最佳培養時間不同??梢杂?0分鐘作為起始孵育時間,之后優化體系以得到均一的標記結果。

【注】:若染色不夠充分,建議增加染料濃度或延長染色時間。

4. 吸干染色工作液,用培養基洗培養板或蓋玻片2~3次,每次用預熱的培養基覆蓋所有細胞,然后吸干培養基。

結果分析:

在熒光顯微鏡下,選用488 nm激發光鏡檢:

AO染色正常細胞DNA呈均勻黃色或黃綠色,形態結構正常。

當細胞凋亡時,染色質濃縮,細胞核碎裂成點狀,被染成大小不一、致密濃染。壞死細胞呈強紅色熒光。

 AO/PI雙染試劑盒說明書

五、注意事項:

1、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內壁上的液體收集至管底,避免開蓋時液體灑落。

2、細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

3、本染色試劑盒可用于細胞、細胞涂片等。以下以懸浮培養細胞的熒光顯微鏡檢測為例,其他方法請參閱相關資料。

4、貼壁細胞可以消化下來染色,也可以直接原位染色。

5、所有細胞都染成了紅色和綠色,沒法區分活細胞和死細胞?

AO/PI染色是一種凋亡形態學的染色方法,需要染色后結合核酸的形態變化進行分析,不是通過顏色差異進行細胞類型的區分。

AO染色是既有綠色也有紅色的,它與細胞中DNA和 RNA結合量存在差別,復合物可發出不同顏色的熒光。AO 與dsDNA 結合時發出綠色熒光,而與 ssDNA和RNA結合時發出紅色熒光。

染色后觀察核酸的形態,正常細胞DNA呈均勻黃色或黃綠色,形態結構正常。當細胞凋亡時,核染色質濃縮,細胞核碎裂成點狀,被染成大小不一、致密濃染。壞死細胞呈強紅色熒光。

凋亡細胞出現細胞體積縮小,連接消失,與周圍的細胞脫離,細胞質密度增加,核質濃縮,核膜核仁破碎,DNA降解成為小片段,形成凋亡小體。

 

六、有效期:2-8 ℃避光有效期為半年

        注:拆封后請盡快使用,有效期為試劑盒未拆封前按要求條件保存的有效期。

AO/PI雙染試劑盒說明書

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