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SEC（Size Exclusion Chromatography）是一種液相色譜分離技術(shù)，也稱為凝膠過濾色譜。SEC能夠?qū)⒍嗑垠w物質(zhì)根據(jù)大小和形狀進(jìn)行分離，所以廣泛應(yīng)用于生化分析和工業(yè)制藥中。SEC重要的組成部分就是色譜柱，因此我們需要了解SEC色譜柱設(shè)計原理。
SEC色譜柱的主要部件是填料，填料的選擇要根據(jù)樣品的特點來定。通常采用的即是硅膠凝膠或者瓊脂糖凝膠，這些凝膠是一類具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)的高分子材料，可提供一定的孔隙用于分離、定量分析及純化目標(biāo)大分子化合物。使用小分子化合物做指示劑，看其在滲透性強的分子篩孔道和顆粒之間晃動情況，再與相應(yīng)的臨界分子量對照確定待測物質(zhì)的分子大小。故SEC的關(guān)鍵在于色譜柱的分離效率和分辨率。
首先，填料粒徑在設(shè)計時很重要。柱子內(nèi)儲存不同尺寸的微粒需要合適的粒徑大小區(qū)分開，因此具有不同孔徑長度的填料列裝方式在SEC色譜柱中被廣泛使用。這樣柱內(nèi)就可以形成一個分子篩效應(yīng)，使得純度更高。
其次，則是填料的類型。如前述，硅膠凝膠和瓊脂糖凝膠是兩種常用的填料，硅膠適合聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚硫化橡膠等水溶性標(biāo)樣，而瓊脂糖凝膠則針對肽類、核酸及寡聚糖等生物大分子，也可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)pH值以重定分離機(jī)理和選擇適當(dāng)?shù)娜軇﹣磉M(jìn)行操作。
然后則是特殊的處理技巧。在一些情況下，可能會出現(xiàn)液相分離的情況導(dǎo)致低分子量多聚體大于高分子量多聚體地往下移動，從而影響測試結(jié)果。因此，在分析部分材料時，需要注意樣本濃度和流速控制，加入一些共軛劑來限制帶電粒子的積聚。
總之，SEC色譜柱設(shè)計需要考慮填料選型、填料粒徑、沉降速率、線速率、柱子規(guī)格、流速等一系列參數(shù)，才能提供符合實驗標(biāo)準(zhǔn)的分離試驗。在應(yīng)用中，需要根據(jù)樣品類型和待檢測成分不同來選擇合適的色譜柱。
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