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張曉夕

在整個制藥行業中，重組單克隆抗體 (mAb) 為生物治療產品在銷售額和臨床份額的快速增長起到了重要作用。最近，因為獨特的治療效果，復雜的蛋白質包括抗體-藥物偶聯物 (ADC)、雙特異性抗體和融合蛋白等重新獲得了科學家們的特別關注。在蛋白質藥物的關鍵質量屬性（critical quality attribute, CQA）評估過程中，電荷異質性需要對蛋白分子進行深入的結構表征，以確保其安全性、有效性和效力。

此外，對電荷變異體的監測也是蛋白質藥物質量控制（QC）中必要的步驟。目前，主要有兩種檢測蛋白質藥物電荷變異體的方法：離子交換(IEX) 色譜和成像毛細管等電聚焦(iCIEF) 或 CIEF，兩者傳統上都使用 紫外（UV） 作為檢測器。UV檢測雖然具有良好的穩定性和靈敏度，但受限于其定性能力，無法對分離后的電荷變異體進行更深入的鑒定。為了分析電荷異構體的成因，必須進行準確的定性分析。高分辨率質譜（HRMS）是定性蛋白質分析的有力手段之一。然而，由于所用溶液體系的限制，傳統上IEX 和 iCIEF 不能直接與質譜連接。鑒于iCIEF在蛋白質電荷變異體分析中具有分辨率高、通量高等優點，已經逐漸成為生物制藥行業生產與質量控制階段的金標準。因此，科學家們也在嘗試各種將iCIEF與高分辨質譜直接連接的技術。其中一種方法是基于芯片的直連技術，然而該方法是使用化學試劑形成pH梯度，穩定性有所欠缺，且分辨率會下降；其他的直連方法在通量、穩定性以及與質譜離子源連接的便利性等方面均有不足。

本文中所使用的CEInfinite (Advanced Electrophoresis Solution Ltd., AES) iCIEF平臺，與該公司的專利卡柱和兩性電解質配合使用，對mAb、ADC等分子的電荷變異體均可實現高分辨率分離，且兼具良好的穩定性。更為重要的是，所用溶液體系中無甲基纖維素、尿素等，兩性電解質也與質譜兼容，這使得iCIEF與高分辨質譜在線直連測量電荷變異體完整蛋白分子量成為可能。該平臺與質譜離子源部分連接簡單，無需額外接口（圖1），不同工作模式切換簡便。

圖1. CEInfinite iCIEF平臺質譜直連模式工作原理圖

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在本文中，我們對NIST mAb（NIST8671）、bevacizumab和pembrolizumab，以及T-DM1這一賴氨酸偶聯的ADC藥物進行了iCIEF-HRMS在線直連分析。根據每個分子及其電荷變異體的pI分布，我們選擇了不同范圍的兩性電解質（表1），目的在于實現不同電荷變異體之間更好的分離。

表1. 樣品配制

對于每個分子，我們也根據其不同性質優化了iCIEF實驗條件，詳見表2。

表2. iCIEF分離條件

實驗條件的優化

由于每個蛋白及其電荷變異體的等電點（pI）分布范圍存在差異，為了在直連質譜時得到最好的分離效果，需要進一步優化iCIEF分離條件。優化時，先用pH范圍較寬的兩性電解質分析目標蛋白得到初步結果，然后再根據初步結果中每個組分不同的pI分布范圍，選用相應的窄pH范圍兩性電解質（優化過程數據未展示）。

在iCIEF的聚焦過程中，蛋白會在電場形成的pH梯度中遷移，直至到達pH=pI的位置，遷移停止。由于蛋白在pI處停止后易沉淀，通常會加入一定濃度的尿素助溶。然而尿素與質譜不兼容，為了解決這個問題，我們的實驗中換用甲酰胺代替尿素，在助溶的同時，也與質譜兼容；對于每個樣品，甲酰胺的濃度同樣也進行了優化（數據未展示），對于大部分樣品，10%(v/v)甲酰胺是最適合的條件。

在iCIEF-MS直連模式中，需要兩路輔助溶劑。一路被稱為mobilization solution（蛋白從卡柱上被推出的溶液，由iCIEF系統配備的蠕動泵完成），該溶液通常為10mM醋酸溶液或0.1-0.5%甲酸水溶液；另一路為make-up solution(由HPLC的泵模塊提供，在柱后與mobilization混合) ，通常使用0.1%甲酸，水：乙腈=1：1的溶液。

因為這兩路溶液的流速會對實驗結果造成影響，我們同樣對這兩個流速分別進行了優化，mobilization solution流速優化范圍30-100nL/min, make-up solution流速優化范圍1-10μL/min，發現mobilization solution流速在40-50nL/min之間iCIEF分辨率最好，50-100nL/min分辨率會下降；mobilizaiton solution= 5μL/min，質譜靈敏度最好。

iCIEF-MS直連模式的重復性

在本實驗中，NIST mAb被用于系統穩定性測試。如圖2所示，圖2A為NISTmAb三針平行進樣結果，可見質譜總離子流圖(total ion current, TIC chromatogram)和主峰解卷積結果均具有良好的重現性；圖2B對NIST mAb的TIC和iCIEF-UV譜圖進行了對比，可見iCIEF分離出的五個電荷異質體峰均可與TIC中的峰一一對應。需要注意的是，由于系統直連的模式，iCIEF分離后的峰是按照pI由大到小的順序依次被引入質譜離子源的，故TIC圖上最先被檢測到的是pI值最大的堿峰，TIC與iCIEF-UV譜圖中峰的分布呈鏡像關系。

(A)

(B)

圖2.iCIEF-MS系統穩定性測試。

 (A)，NIST mAb三針平行進樣。

(B)，NIST mAb 質譜總離子流圖(TIC)與iCIEF-UV譜圖對比。

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iCIEF-MS分析bevacizumab

圖3展示了iCIEF-MS分析bevacizumab的結果。從圖3A的iCIEF-UV譜圖中可以看出，總共有六個電荷變異體的峰被分離并鑒定到，包括三個酸峰(A1-A3)，兩個堿峰(B1-B2)和主峰(M)，均可在TIC-MS譜圖中找到對應的峰。圖3B為使用Thermo Fisher Biopharma Finder 5.0 (BPF 5.0)軟件對各個電荷變異體進行解卷積之后的結果，可見在兩個堿峰中，主要的電荷變異體分別為重鏈末端保留一個賴氨酸(B1)和兩個賴氨酸均被保留(B2)的形式；在酸峰中，主要觀察到的電荷變異體為糖化(+162Da)。

表3列出了iCIEF-MS鑒定到的bevacizumab電荷變異體。對于酸峰中常見的脫酰胺化修飾，由于其修飾后分子量僅增加0.984Da，通常需要在肽圖層面上進一步確認。

(A)

(B)

圖3. iCIEF-MS分析bevacizumab。

(A), TIC-MS與iCIEF-MS譜圖對比。

(B), 經iCIEF分離后的bevacizumab電荷變異體質譜數據解卷積結果。

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表3. iCIEF-MS鑒定到的bevacizumab電荷變異體

iCIEF-MS分析pembrolizumab

下圖4及圖5展示了我們使用iCIEF-MS直連技術分析pembrolizumab電荷變異體的結果，可見即使是pI僅差0.02的堿峰B1和主峰，也可以在iCIEF上得到基線分離(圖4A)，隨后的高分辨質譜分子量測定結果顯示該堿峰與主峰相比，主要差異是其中一條重鏈的N端未發生焦谷氨酸環化（圖5B-C）。另外觀察原始質譜譜圖不難發現，得益于Orbitrap高分辨質譜的靈敏度，即使是強度比主峰低2~3個數量級的堿峰B3，仍可得到糖型分布清晰的譜圖，并可通過解卷積觀察到該峰中各個組分的分子量，例如重鏈末端丟失GK(-185Da)的電荷變異體也在堿峰B3中被鑒定到（圖5D）。表4展示了iCIEF-MS直連測得的每個峰中主要的電荷變異體種類。

(A)                                  (B)

圖4. (A), pembrolizumab iCIEF- UV 分離譜圖。(B), pembrolizumab各個電荷變異體百分含量，上樣量為柱上1.6μg。A1-A4, 酸峰; Main, 主峰; B1-B3, 堿峰。

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圖5. iCIEF-MS分析pembrolizumab電荷變異體質譜圖及解卷積譜圖。

(A)，主峰與所有堿峰原始質譜圖對比。

(B)，堿峰B1(pI=7.59)與主峰(pI=7.57)解卷積結果鏡像圖對比。

(C)，基于肽圖得到的主峰和堿峰B1重鏈N端焦谷氨酸環化比率。

(D)，堿峰B3解卷積結果。

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表4 iCIEF-MS在線直聯鑒定pembrolizumab電荷變異體。HC，重鏈。

iCIEF-MS分析ADC

ADC是一類經過細胞工程設計，將小分子藥物通過linker分子偶聯至mAb分子特定氨基酸位點上，通過mAb對細胞表面的靶點精確識別后，將小分子藥物定向導入癌細胞中，以實現精準殺滅癌細胞，減少對正常細胞殺傷的一類蛋白質藥物。由于小分子藥物的偶聯增加了產品的復雜性，故在質譜分析之前，通過各種分離技術對偶聯了不同數目小分子藥物的ADC進行預分離，可大大降低質譜數據的復雜度和解析難度。圖6展示了iCIEF-UV分析ADC的譜圖，可見由于偶聯小分子藥物的數目不同，ADC的電荷異質性也不同，可以在iCIEF層面上得到分離。圖7展示了iCIEF-MS分析ADC的質譜譜圖及解卷積結果，可見iCIEF將對偶聯了不同數目小分子藥物的ADC根據其電荷異質性進行分離后，能夠減少質譜譜圖中相鄰信號之間的干擾，從而降低質譜譜圖的復雜度，使質譜譜圖的解析更精確和便利。

圖6. iCIEF-UV 分析T-DM1譜圖，上樣量1.6μg。D0-D10, 小分子藥物偶聯數目。

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圖7. iCIEF-MS分析T-DM1質譜譜圖及解卷積結果（分離后未偶聯小分子藥物的組分，D0）。iCIEF分離大大降低了譜圖復雜度。

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基于iCIEF分離的

蛋白電荷變異體離線餾分收集

 iCIEF-MS可以從完整蛋白層面上提供蛋白電荷變異體的分子量信息，如需更多修飾位點層面的信息，可以對iCIEF分離的蛋白電荷變異體離線餾分收集后進行酶解，隨后使用HPLC-MSMS進行肽圖表征。圖8展示了pembrolizumab蛋白電荷變異體離線餾分收集的iCIEF-UV譜圖，更多詳細信息可參考已發表文獻[1]。

(A)

(B)

圖8. Pembrolizumab 電荷變異體離線餾分收集及確認。

(A) 離線餾分收集。iCIEF-UV為10針平行進樣的重疊，插入表格為每個峰以峰面積計算的相對含量和10針平行進樣的CV。

 (B) 峰純度確認，每個峰均為5針平行進樣，同一個pI收集峰的混合。

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在生物醫藥行業中，快速且準確的電荷變異體分析是關鍵需求之一。本文中使用的iCIEF在線直連高分辨質譜工作流程，能夠克服CE-MS在靈敏度、重現性等方面的不足，特別是我們使用的CEInfinite平臺可以靈活的在不同工作流程之間轉換，實現蛋白質電荷變異體表征中的“一站整合式” iCIEF分析。

原文參考

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參考文獻

[1] X. Zhang, T. Chen, V. Li, T. Bo, M. Du, T. Huang, Cutting-edge mass spectrometry strategy based on imaged capillary isoelectric focusing (iCIEF) technology for characterizing charge heterogeneity of monoclonal antibody, Analytical Biochemistry 660 (2023) 114961.

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