在腫瘤發生發展過程中，包括但不限于巨噬細胞、DC（dendritic cell）、中性粒細胞、B細胞、T細胞、CAF（tumor associated fibroblast）等多種細胞被招募到腫瘤細胞周圍的微環境中，與ECM（extracellular matrix）等元素共同構成腫瘤免疫微環境TIME（tumor immune microenvironment）。

在TIME中的多種成分，包括T細胞、B細胞以及分泌的相關因子等雖然對腫瘤起著免疫作用，但還有許多其它成分，如細胞方面包括M2型巨噬細胞、Treg細胞、Th2細胞及MDSC （Myeloid?derived suppressor cell）等發揮著免疫抑制的作用，細胞因子方面IL-4、IL-5、IL-10、TGFβ、MMP9和VEGF等等也通過特定的機制起著促進免疫逃逸和腫瘤發生發展的作用。在免疫的過程中，腫瘤細胞也衍生出了各種對抗免疫的機制，例減少抗原的表達，抑制DC細胞的抗原遞呈能力，抑制細胞毒性T細胞的浸潤等等。

在過去的十年里，雖然關于TIME的研究文章呈逐年遞增的狀態，TIME方向作為國自然研究的熱點，提供了大量的基金支持，但鑒于TIME的復雜性以及癌癥治療的困難性、高復發率，對TIME的研究仍任重道遠。在這里，小優博士又整理了兩篇近期發表的關于TIME的高分文章，分別從研究背景、主要研究結果方面分享給大家，并對相關的研究思路做了部分總結，希望對大家的科學研究起到幫助作用。

一、單細胞轉錄組學揭示癌癥相關成纖維細胞在復發性骨肉瘤腫瘤免疫微環境中的調節作用

研究背景：
骨肉瘤是最常見的骨腫瘤之一，主要發生在青少年。盡管在手術和化療方面取得了很大的成就，但骨肉瘤患者的預后仍不理想。復發性骨肉瘤是臨床的一大挑戰，復發性骨肉瘤患者預后較差。因此，迫切需要深入探討骨肉瘤的進展機制，加強對復發性骨肉瘤的認識。

腫瘤微環境(Tumor microenvironment, TME)主要由多種細胞類型和細胞外基質組成，與癌細胞相互作用，促進癌癥進展。癌癥相關成纖維細胞(CAFs)是TME中最常見的細胞，可通過癌癥干細胞更新、免疫治療療效減弱和化療耐藥性導致癌癥進展。然而，CAFs免疫抑制特征在OS中的作用和機制值得進一步研究。

單細胞RNA測序(scRNA-seq)是一種強大的新工具，可以檢測遺傳和功能異質性，重建細胞成分及其相互作用，并檢測罕見的TME亞群。ScRNA-seq用于識別和分析OS的精確細胞簇和組成。然而，這些研究都集中在細胞成分上，并沒有明確闡明TME在OS進展中的作用和機制。

本研究在前期研究GSE152048和GSE162454的基礎上，利用scRNA-seq和生物信息學技術揭示CAFs在復發性OS TME中的調控作用。這可能在單細胞水平上促進對CAFs在復發性骨肉瘤TME中的作用和機制的理解，為骨肉瘤的治療提供新的靶點。

首先，為了便于大家理解本文的研究思路，作者精心制作了一個研究流程圖，如下：根據GSE152048 (BC)和GSE162454 (OS)的數據集，作者進行了scRNA-seq分析，以研究原發性、復發性和肺轉移性骨肉瘤病變的細胞構成。GSE152048 (BC)包括來自7個原發、2個復發和2個肺轉移性OS病變的100987個細胞。GSE162454 (OS)包括29278個細胞，這些細胞來自6個原發性OS患者在接受新輔助化療之前。此外，作者又使用三個配對的原發性和復發性OS樣本，通過免疫熒光、預后分析等方法來驗證scRNA-seq的結果。

文章研究路線圖

主要結果部分：
1 復發性OS中，CAFs的浸潤水平較高
經過數據分析發現，原發性、復發性和肺轉移性OS病灶中鑒定出14種細胞類型（A），且三種OS病灶的t-SNE圖疊加，發現復發性OS病變的Div-CAFs（diverse CAF）較突出(B)。雖然細胞種類在三種類型的OS病灶中沒有大的差異，但部分比例變化非常大，尤其是腫瘤相關成纖維細胞CAF，原發性與復發性的比例為3.58%和96.42% (C)，說明了復發性OS中，CAFs的浸潤水平比較高。

2 在復發性OS患者組織中，CAFs與EMT相關
對原發性和復發性OS病灶中對差異表達的HALLMARK基因進行通路富集分析，發現EMT（上皮間充質轉化）通路相關基因在復發性OS組織中明顯激活。

3 遺傳學方面證明CAFs在復發性OS中具有較高的浸潤性
（a）    WB檢測發現與OS細胞相比，CAFs具有較高的N-cadherin ( EMT 的marker )表達和較低的E-cadherin表達。同樣在復發性OS中，由于CAFs的浸潤較多，N-cadherin表達也較高(A)。
（b）    CAFs激活marker：(a-SMA：recombinant stromal cell derived factor 1，FAP: fibroblast activation protein) a-SMA和FAP在復發性OS組織中顯著升高(B)。
（c）    通過TIMER數據庫分析，FAP與EMT 的marker E-cadherin顯著負相關，而與N-cadherin顯著正相關(C)。
（d）    IF實驗補充表明復發性OS組織中的a-SMA表達高于原發骨肉瘤組織，E-cadherin表達較低(D)。

4 CAFs表達的LOX的表達模式及臨床意義
LOX: lysyl oxidase,賴氨酸氧化酶，是細胞外基質中分泌的一種酶，底物是膠原蛋白和彈性蛋白（骨和肺的主要成分），這也是為什么骨肉瘤容易向肺部轉移的一個主要原因。

通過對CAFs和Div-CAFs細胞中差異表達的基因數據分析(A, B)及IHC實驗(C, D)驗證表明LOX在復發性OS組織中較原發性高，預后分析也表明LOX的高表達導致明顯的預后較差(E)。

5 在體外LOX 促進復發性OS
接下來，作者用LOX的抑制劑BAPN (3-Aminopropionitrile是一種特異性的不可逆LOX抑制劑，作用于LOX或LOXL同工酶的活性位點)進行處理，發現：CAF細胞降低，OS及TAM細胞無明顯變化（A）；CAF的基質激活marker a-SMA和FAP表達量降低（B）；N-cadherin ( EMT 通路的marker )表達降低（C, D）；OS 細胞的遷移率及傷口愈合速率均明顯降低篇（E）；另外檢測到起促進免疫反應的M1類型的巨噬細胞（INOS）明顯升高而抑制免疫反應的M2型巨噬細胞（CD163）降低（F）。

6 在體內，LOX抑制產生抗OS作用
接下來在體內驗證LOX的作用，對腫瘤進行異種移植，經BAPN處理后，檢測到腫瘤體積降低， LOX表達水平降低（A，B）；CAF的基質激活marker a-SMA和FAP表達量也降低（C）；同樣的與體外檢測結果一致，M1類型的巨噬細胞明顯升高而M2型巨噬細胞降低（D）；最后，CD8細胞有所升高但不明顯（E）。

最后，作者制作了一張示意圖，對本文的研究做出總結。即在復發性骨肉瘤中，CAFs浸潤水平較高，在復發性OS的細胞類型中，LOX在CAFs中表達量最高，BAPN抑制LOX可調節CAFs功能，誘導巨噬細胞向促進免疫的M1類型極化，進而抑制OS。

二、MUC1-C在三陰性乳腺癌中整合IFN-γ通路的激活和腫瘤免疫微環境的抑制

Doi:10.1136/jitc-2020-002115

研究背景：
三陰性乳腺癌(TNBC)是一種侵襲性疾病，治療選擇有限。TNBC患者通常采用新輔助或輔助化療。TNBC患者對化療反應的生存期改善與腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)的存在有關。因此，腫瘤免疫微環境(TIME)中TILs (特別是CD8+ T細胞)的增加可以預測早期TNBC患者對治療的反應和預后的改善。

MUC1-C是一種在TNBC細胞中異常表達的致癌蛋白。MUC1-C通過誘導上皮細胞-間充質轉化(EMT)、表觀遺傳重編程、干性、自我更新能力來驅動TNBC細胞進展中的譜系可塑性。EMT和癌癥干細胞狀態與免疫逃避有關，盡管機制尚不清楚。

本文對大量和單個TNBC細胞RNA-seq數據集的分析進一步表明，MUC1與JAK1、STAT1、IRF1、IDO1和PTGES的內在表達有關。在TNBC的腫瘤免疫微環境中，MUC1與CD8+ T細胞的衰竭和功能障礙有關。這些發現為MUC1-C在TNBC中整合譜系可塑性和免疫抑制提供了新的見解。

主要結果部分：
1 MUC1-C激活IFN-γ→JAK1→STAT1信號通路富集的整個轉錄程序
對BT-549 TNBC細胞的整體轉錄譜分析表明，誘導MUC1-C沉默可導致基因表達的廣泛變化，約有2300個基因的表達產生了下調，1100多個基因的表達有所上調（A）。進一步分析發現沉默MUC1-C會導致(1)STAT1和IRF1（B）以及(2) IFN通路反應基因的下調（C），與MUC1-C誘導的表達模式相關的主要調控因子包括STAT1和IRF1，證實MUC1-C通過STAT-IRF轉錄因子活性介導信號傳導(D)。Motif評估進一步驗證了MUC1-C誘導的差異表達基因在STAT和IRF Motif中高度富集(E)?？傊?，這些發現表明STAT-IRF因子是MUC1-C誘導的TNBC細胞轉錄應答的主要驅動因素。

2 在TNBC細胞中MUC1-C激活JAK1→STAT1→IRF1信號
接下來，在BT-549和SUM149細胞中降低MUC1-C基因的表達，發現STAT1和IRF1基因在mRNA及蛋白水平的表達均有所降低（A-C）。通過對MUC1-C基因的蛋白序列分析，發現MUC1-C包含分別結合JAK1和IRF1的兩個motif，JAK1作為激酶，當MUC1-C結合兩種蛋白時，便會對STAT1進行磷酸化，因此在前面的實驗結果中，由于MUC1-C基因的下調，磷酸化的pSTAT1蛋白也降低（A-C）。接下來，通過用MUC1-C的抑制劑GO-203抑制MUC1-C的表達，同樣檢測到了JAK1，STAT1，pSTAT1, 及IRF1蛋白表達的下調，再次驗證了之前的結果。

3 下調MUC1-C 抑制IRF1下游基因 IDO1 和 COX2/PTGES
MUC1-C下調后，作者又對下游基因IDO1在BT-549及COX2/PTGES的表達情況進行了檢測。檢測到在BT-549、SUM149細胞中及抑制劑GO-203處理后，IDO1表達水平均降低（B-D）。 此外，作者發現MUC1-C驅動COX2/PTGS2和PTGES (E)的表達，它們共同合成PGE2 (一種與TNBC腫瘤生存率降低相關的T-cell功能抑制劑)。為了支持這些結果，對MDA-MB-468 TNBC細胞的研究證實MUC1-C驅動COX2和PTGES的表達(F-G)。

4 MUC1 與免疫細胞浸潤的減少有關
接下來，為了檢測MUC1-C對免疫細胞浸潤的影響，作者對兩種RNA-seq數據TCGA-BRCA cohort（A）及METABRIC cohort (B)進行了分析，結果顯示，相對于MUC1-C表達低的腫瘤，MUC1-C表達高的腫瘤中的免疫細胞浸潤明顯減少，特別是CD8 + T細胞、CD8 + naive T細胞、B細胞和Th2細胞等（C, D）。在MUC1-C表達低和MUC1-C表達高的情況下，細胞類型富集的總體模式在TCGA-BRCA和METABRIC隊列中顯著相關（E, F）。此外，在兩個數據中，基于所有免疫細胞類型估計的總免疫活性的定量在MUC1-C表達高的情況下顯著降低（G）。

5 MUC1-C在TNBC腫瘤中的表達與IFN-γ通路的激活和CD8+ T細胞的衰竭和功能紊亂有關
結合實驗結果及通過對TNBC腫瘤中TCGA-BRCA和METABRIC數據分析，發現MUC1與IFN-γ通路的激活有關（A, B）；MUC1-C的表達與CD8+ naive T細胞的耗竭顯著相關（C, D）；IFN-γ通路在t細胞功能紊亂的TNBCs中高度富集（E, F）；此外還發現MUC1-C在兩種TNBC數據集中都與T-cell功能障礙顯著相關，這表明MUC1-C誘導的IFN-γ通路激活導致CD8+ T細胞排斥和功能障礙。
最后，對本文的研究做出總結，MUC1-C通過誘導IDO1和COX2激活IFN-γ→STAT1→IRF1通路（I），這為MUC1-C在TNBC的腫瘤免疫微環境中驅動CD8+ T細胞排斥和/或功能紊亂的潛在重要性提供了支持。

總結，在看了一些關于腫瘤免疫微環境相關的文章后，對于一些研究思路，小尤博士做了一些總結，并形成了一個流程圖，當然不能代表所有相關的思路，希望為各位小伙伴的研究帶來一些參考作用。

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