首先需要明確納米微孔的數(shù)量

是如何影響dPCR的定量結(jié)果。

dPCR采用直接計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行定量分析，即在PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將有熒光信號(hào)的納米微孔記為1，無(wú)熒光信號(hào)記為0（定量是二進(jìn)制的，因此稱為“數(shù)字”）。有熒光信號(hào)的微孔說(shuō)明至少含有一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子。在目標(biāo)DNA濃度極低的情況下，理論上可以認(rèn)為有熒光的納米微孔數(shù)目就等于DNA分子的拷貝數(shù)，但通常情況下，數(shù)字PCR的納米微孔中可能會(huì)包含兩個(gè)甚至更多的目標(biāo)分子，因此需要采用泊松概率分布公式來(lái)進(jìn)行計(jì)算：

λ = ?ln (1 ??p)

λ：每個(gè)微孔的目標(biāo)分子的平均數(shù)量

p：具有正信號(hào)的納米微孔數(shù)量與微孔總數(shù)的比值。

可以使用λ計(jì)算出目標(biāo)分子的絕對(duì)數(shù)量【2】，很明顯，微孔數(shù)越多，檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍就越廣【3】。

圖1的泊松概率分布曲線圖更直觀地體現(xiàn)了這一點(diǎn)：

如圖1顯示，隨著陽(yáng)性微孔比例（p）的增加，體系中目標(biāo)分子的平均拷貝數(shù)會(huì)有較大的差距，隨著p的持續(xù)增加，dPCR結(jié)果的不確定度也隨著提高。總體來(lái)說(shuō)，dPCR陽(yáng)性微孔數(shù)量不得超過總微孔數(shù)量的80%，總反應(yīng)微孔數(shù)的增加提高的是dPCR檢測(cè)的線性范圍。

在傳統(tǒng)模擬分析中，測(cè)量的不確定度通常受檢測(cè)儀器分辨率的限制，例如，熒光檢測(cè)器分辨熒光信號(hào)微小差異的能力。但在dPCR 檢測(cè)中，檢測(cè)儀器只需要識(shí)別每個(gè)納米微孔是否有0個(gè)或大于1個(gè)目標(biāo)分子，因此dPCR的數(shù)據(jù)分析較少依賴于檢測(cè)器的特性。排除了檢測(cè)器對(duì)dPCR定量結(jié)果的影響，那么下一個(gè)需要明確的信息是什么呢？

需要明確的是

引起dPCR偏差的來(lái)源有哪些。

dPCR主要有2個(gè)引起偏差的來(lái)源，分別是：二次采樣誤差和分區(qū)誤差。二次采樣過程引入了不可避免的誤差源，尤其是當(dāng)原始樣本中要檢測(cè)的目標(biāo)很少時(shí)，設(shè)定了檢測(cè)下限，儀器本身能兼容的二次采樣體積越大，一定程度上能提高檢測(cè)的靈敏度。

根據(jù)泊松分布原理，陽(yáng)性微孔比例不超過80%，所以分區(qū)誤差在原始樣本濃度較高的情況下占主導(dǎo)地位。在一組重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，若信號(hào)為0的微孔數(shù)量存在差異，該差異會(huì)引起總反應(yīng)體系中目標(biāo)結(jié)果計(jì)算的差異。根據(jù) Dube 等人的分析，可以找到對(duì)分區(qū)誤差的計(jì)算方式【4】【5】，根據(jù)該計(jì)算方式我們可以比較不同納米微孔數(shù)量下的分區(qū)誤差【6】。

圖2比較了20,000個(gè)微孔和1,000,000個(gè)微孔的二次采樣和分區(qū)誤差與樣本濃度的關(guān)系。在dPCR中，通常將每個(gè)納米微孔中的模板拷貝數(shù)λ的范圍調(diào)整到0.001到6【4】（在某些情況下，可以高達(dá)8【7】）。在納米微孔N為1,000,000時(shí)，分區(qū)錯(cuò)誤顯著下降到<3%，說(shuō)明微孔數(shù)量越多，越能降低分區(qū)誤差，從而提高dPCR的檢測(cè)準(zhǔn)確度。

圖2 . ( A ) 20,000 個(gè)分區(qū)和 ( B ) 1,000,000個(gè)微孔的

二次采樣和分區(qū)誤差與樣本濃度的關(guān)系

（圖片來(lái)源：羅氏診斷整理）

由dPCR定量的原理分析得出，“分”成的納米微孔數(shù)量與定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測(cè)范圍緊密相關(guān)，總結(jié)下來(lái)就是：微孔越多，dPCR結(jié)果越準(zhǔn)確，動(dòng)態(tài)范圍越廣。