糖基化是一種常見的蛋白藥物翻譯后修飾（PTM），在抗體關鍵質量屬性中起著重要作用【1】。生物制品中N-和O-糖基化的深度表征對于確保藥物安全性和有效性至關重要【1】。當應用于糖肽時，傳統的基于碰撞的MS/MS方法，如碰撞誘導解離（CID），會導致不穩定聚糖部分的丟失。因此，使用CID精確測定糖基化位點非常具有挑戰性，尤其是對于沒有共有序列的O-糖基化。與CID相比，電子活化解離（EAD）在糖肽分析方面具有優勢，因為它能夠保存片段中的聚糖結構。依那西普是一種二聚體融合蛋白，由兩條腫瘤壞死因子受體（TNFR）-Fc鏈組成，每條鏈上有3個N-糖基化和13個O-糖基化位點，本文將詳細闡述EAD在糖肽水平上分析O-糖基化信息，采用EAD DDA或MRM^HR方法來表征去乙酰化依那西普的復雜O-糖基化特征。【2-4】。

SCIEX基于糖基化深度表征方案的特點：

1.EAD 準確鑒定糖基化位點：不穩定聚糖可以保留在EAD碎裂片段中，可準確鑒定糖基化位點，并可靠區分O-糖肽的位置異構體。

2.高質量的靈敏度和MS/MS數據：ZenoTOF 7600系統的Zeno阱可將MS/MS碎片的靈敏度提高5-10倍，從而實現高質量的MS/MS靈敏度和譜圖質量。

3.快速靈活：EAD可在數據依賴采集（DDA）或高分辨定量（MRM^HR）模式下運行，具有快速掃描速率（DDA模式下約20 Hz）和可調整電子動能（0-25eV）的能力。

4.強大的數據分析平臺：Biologics Explorer軟件為肽圖和PTM分析提供了強大、直觀的分析能力。

含1個O-糖的糖肽

圖1顯示了兩種胰蛋白酶酶切的O-糖肽（L1-R19和T243-K268）的EAD譜圖，它們含有一個核心聚糖結構（HexNAcHex）。兩個肽段都含有3個潛在的O-糖基化位點（2個Thr和1個Ser），但只有一個位點被HexNAcHex修飾。如圖2所示，EAD產生了質量優異的MS/MS碎片信息，具有幾乎完整的c/y/z片段序列，可以對這兩種O-糖肽的進行可靠鑒定和聚糖的準確定位。具體而言，基于c7/c9和y11/z12片段的m/z，肽段L1-R19（圖1A）中的O-糖基化位點被確定為T8，而基于檢測到非糖基化c2/y23片段和包含糖基化的c3/y24/z24片段，肽段T243-268（圖1B）中的T245被HexNAcHex修飾。

圖1. 單O-糖基化肽段L1-R19（A）和T243-K268（B）的EAD譜圖（1eV）。兩種胰蛋白酶切肽段含有多個可能的O-糖基化位點（Ser和Thr），其中一個被核心聚糖結構（HexNAcHex）修飾。優異的EAD MS/MS譜圖允許O-糖在肽段L1-R19（A）中的T8處和肽段T243-K268（B）中的T245處可靠定位。

圖2. 用6（A）或7（B）HexNAcHex修飾的O-糖肽S202-K238的EAD MS/MS譜圖（7 eV）。O-糖肽S202-K308含有多達7個O-聚糖，使用EAD對含有6（A）或7（B）HexNAcHex的物種實現了O-糖的準確定位。請注意，圖2A顯示了含有6 HexHAcHex的兩種位置異構體之一的EAD MS/MS譜圖，兩種異構體的區別見圖3。

我們觀察到糖肽S202-K238的兩種位置異構體，其含有6個HexNAcHex部分。圖3顯示了特征EAD片段，即用于區分這兩種異構體的雙電荷c11、c12和c15。從兩種異構體的EAD產生的c12的m/z差異（365 Da）表明，T213（序列中的T12）在異構體1中被O-糖基化（圖3B），但在異構體2中沒有（圖3E）。兩種異構體的c15的m/z相同的事實表明，S216（序列中的S16）在異構體2中被HexNAcHex修飾（圖3F），但在異構體1中未被糖基化（圖3C）。這些結果證明了EAD在正確區分位置異構體方面的能力，這對傳統的基于碰撞的MS/MS方法（如CID）是無法完成的。

圖3. 區分含6個HexNAcHex O-糖肽S202-K238的兩種位置異構體的特征c離子。兩種異構體（異構體1和異構體2）分別基于在相同m/z下檢測c112+和c152+離子（A和D）和包含異構體1（B）和異構體3（E）的4個和3個 HexNAcHex的c122+片段來區分。c122+的m/z表明，序列中的T12在異構體1（B）中被HexNAcHex修飾，但在異構體2（E）中沒有，其中基于c152+（F）的m/z信息，S15被糖基化。

總結

4. EAD方法可用于闡明蛋白藥物治療中的復雜糖基化譜圖信息。