2012年鐵死亡被發現后，它的相關研究經歷了指數級的增長，也是近幾年熱門中的 “熱門”。小優曾用3篇文章詳細的剖析過它，從研究歷程到正式命名，再到通路研究，都有詳細解讀，不清楚的同學可以戳鏈接再了解。

在今年的3月17日，美國Broad研究所Todd R. Golub研究組與Peter Tsvetkov合作在Science上發表了題為“Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins” 的研究文章。文章一經發布，“銅死亡”一詞迅速霸屏。可以預見，未來幾年，銅死亡的相關研究，也會迎來“井噴式”爆發。

為了方便各位快速了解銅死亡，大家拿好小板凳做好，小優課堂馬上就要開課了。

本文核心觀點：
1. 揭示了一種新的細胞死亡機制——銅死亡，證明銅誘導的細胞死亡是由蛋白質脂酰化所介導的 
2. 銅死亡是通過銅與TCA循環的脂酰化成分直接結合而發生的，這導致脂酰化蛋白質聚集，以及鐵硫簇蛋白質丟失，從而導致蛋白質毒性應激并最終導致細胞死亡
3. FDX1是蛋白質脂酰化的上游調節因子，FDX1和蛋白質脂酰化是銅死亡的關鍵調節因子

Over！接下來讓我們細細研磨這篇文章的精華，感受高分文章的魅力所在吧！

銅是所有生物體不可少的輔助因子，通過跨濃度梯度起作用的主動穩態機制可以將細胞內銅濃度保持在非常低的水平，以防止對細胞有害的游離銅的累積。不過銅穩態的遺傳變異會導致致命的疾病，并且銅離子載體和銅螯合劑都被認為是抗癌劑。然而，過量的銅如何誘導細胞死亡尚不清楚。

銅離子載體是與銅結合的小分子，可以將銅運送到細胞內，因此是研究銅毒性的有用工具。多條證據表明，銅離子載體誘導細胞死亡的機制涉及細胞內銅的積累，而不是小分子伴侶本身的作用。

一、銅離子載體誘導一種特別形式的受調節的細胞死亡

為了確定銅離子載體的細胞毒性是否依賴于銅本身，研究人員首先利用Elesclomol這種銅離子載體驗證了僅有銅離子能夠介導細胞的死亡，而搭載其他金屬離子時不具備對細胞殺傷的活性。接下來驗證了銅離子介導細胞死亡的機制，通過凋亡的標志物檢測，以及凋亡或鐵死亡的抑制劑均不能抑制銅離子所介導的細胞死亡，這表明銅離子載體誘導的細胞死亡很可能是一種新的細胞死亡途徑，明顯區別于傳統的凋亡、鐵死亡和壞死等細胞死亡方式。

圖1：銅離子載體誘導的細胞死亡與傳統死亡途徑不同

A：在489個細胞系中測試了1448個載銅藥物對細胞的殺傷效果，結果表明這些載銅藥物均能殺傷細胞
B：單獨加入Elesclomol不影響細胞的生長，而一旦加入銅離子，細胞生長受到極大抑制。相反，加入其他金屬，例如鐵鈷鋅鎳等也不影響細胞生長
C：用濃度低至40nM的銅離子載體Elesclomol脈沖處理，2ｈ細胞內銅水平增加15至60倍，超過24小時后引發細胞死亡。該結果表明銅介導的細胞死亡確實受到調節
D、E：Elesclomol誘導的細胞死亡不涉及caspase 3活性的切割或激活
F、G：當細胞凋亡的關鍵效應子BAX和BAK1被敲除或當細胞與泛半胱天冬酶抑制劑共處理時，Elesclomol仍能誘導細胞死亡，再次表明銅誘導的細胞死亡與細胞凋亡不同
G、H：銅誘導的細胞死亡與已知細胞死亡機制不同

二、線粒體呼吸調節銅離子載體誘導的細胞死亡

研究人員觀察到更依賴線粒體呼吸的細胞對銅離子的敏感性比進行糖酵解的細胞高近1000倍。如果采用藥物干預線粒體功能后，細胞對銅離子的敏感性發生顯著變化。通過乏氧條件培養細胞，研究人員進一步證實了銅誘導的細胞死亡需要線粒體呼吸參與，而糖酵解產生的ATP方式，對銅誘導的細胞死亡影響較小。進一步研究發現，用銅離子載體處理不會顯著降低基礎呼吸或ATP相關呼吸，但會顯著降低呼吸的儲備能力，這表明銅不直接靶向ETC，而是靶向TCA循環的組成部分。

圖2：線粒體呼吸調節銅離子載體誘導的細胞死亡

A：更依賴線粒體呼吸的細胞對銅離子的敏感性比進行糖酵解的細胞高近1000倍
B：用線粒體抗氧化劑等處理，對銅離子載體的敏感性具有非常明顯的影響。ETC的復合體I/II的抑制劑以及線粒體丙酮酸攝取的抑制劑能減少細胞死亡，但對鐵死亡沒有影響
C：線粒體解偶聯劑FCCP對銅毒性沒有影響，這表明銅誘導的細胞死亡需要線粒體呼吸
D：低氧條件下，銅誘導的細胞死亡減弱，進一步強調了細胞呼吸在介導銅誘導的細胞死亡中的作用
E：銅不直接靶向ETC而是靶向TCA循環的組成部分
F：銅離子載體誘導的細胞死亡和線粒體代謝之間的聯系

三、FDX1和蛋白硫辛酰化是銅離子載體誘導細胞死亡的關鍵調節因子

為進一步研究銅離子和 TCA 循環之間的聯系，研究人員使用 CRISPR-Cas9 技術，分別敲除不同的基因，再使用銅離子載體處理細胞，以確定涉及參與銅離子載體誘導細胞死亡的基因。結果發現有7個基因的敲除可以明顯緩解銅離子載體介導的細胞殺傷作用，包括 FDX1，LIPT1、LIAS、DLD (硫辛酸途徑的三個關鍵酶)，DLAT、PDHA1、PDHB (丙酮酸脫氫酶復合體的三個組分)。另外，敲除 FDX1 和 LIAS 基因明顯減輕銅離子載體引起的細胞毒性，這進一步加強了FDX1和銅誘導的細胞死亡之間的功能聯系，也因此，研究人員猜測 FDX1 有可能是蛋白質硫辛酰化修飾的上游調節因子。

圖3：FDX1 和蛋白硫辛酰化是銅離子載體誘導細胞死亡的關鍵調節因子

A-C：敲除了不同基因后，細胞參與銅離子載體誘導的死亡的基因（藍色）
D：硫辛酸通路的示意圖
E：代謝酶篩選顯示，復合物I的基因抑制也使細胞免于銅誘導的死亡
F、G： FDX1和LIAS的缺失賦予了對銅誘導的細胞死亡的抵抗力

四、FDX1 是蛋白質硫辛酰化的上游調節因子

為了驗證上述猜測，研究人員首先通過檢索公共數據庫，發現FDX1和硫辛酸代謝相關蛋白在銅離子載體誘導細胞死亡方面是高度相關的。其次，對208例人類腫瘤樣本進行了FDX1和硫辛酰化蛋白的免疫組織化學染色，發現FDX1和硫辛酰化蛋白的表達高度相關。之后，通過免疫印跡和免疫組織化學檢測，發現敲除FDX1會導致DLAT 和 DLST 蛋白的硫辛酰化*喪失，同時也導致細胞呼吸水平顯著下降。這些結果均表明FDX1是蛋白質硫辛酰化的上游調節因子。

圖4：FDX1 是蛋白質硫辛酰化的上游調節因子

A：FDX1 敲除的相關基因網絡
B-C：腫瘤樣本的 FDX1 和硫辛酰化蛋白的免疫組化染色
D：敲除 FDX1，檢測硫辛酰化蛋白的表達量
E：敲除 FDX1 ，檢測細胞耗氧率
F：敲除 FDX1，檢測與硫辛酰化途徑相關的代謝物的變化

五、銅直接結合并誘導硫辛酰化 DLAT 的寡聚化

上述實驗已經建立了銅毒性和蛋白質硫辛酰化之間的聯系，但沒有確定直接的機制。有研究報道銅離子與游離脂酸的解離常數為 10–17，這表明銅離子有可能直接與硫辛酰化蛋白結合。

為了驗證這一猜想，研究人員純化了DLAT和DLST蛋白，發現二者都可以與偶聯銅的樹脂結合。而敲除FDX1會導致DLAT蛋白的硫辛酰化修飾消失，且 DLAT和DLST也不再與偶聯銅的樹脂結合。這表明蛋白質的硫辛酰化修飾是結合銅的必要條件。此外，銅與硫辛酰化蛋白 DLAT 的結合，會導致蛋白的寡聚化，而 Elesclomol 處理會增加 DLAT 蛋白的寡聚化。

圖5：銅直接結合并誘導硫辛酰化 DLAT 的寡聚化

A：細胞提取蛋白和偶聯銅的樹脂的結合
B-E：IB 分析 DLAT 蛋白寡聚化
F-H：強還原劑TCEP處理，表明寡聚體是二硫鍵依賴性的

六、銅誘導細胞死亡機制與銅穩態失調的遺傳模型相同

為了探討與銅離子載體治療相關的銅毒性機制是否與這些自然發生的銅穩態失調有關，研究人員檢查了三個實驗模型。首先，在HEK 293T和ABC1細胞中過表達SLC31A1，這顯著增加了對生理銅濃度的敏感性。另外，過表達 SLC31A1 的細胞被銅離子載體處理后，蛋白硫辛酰化減少，Fe-S簇蛋白水平降低，HSP70 水平升高。

在過表達SLC31A1的細胞中，鐵死亡、壞死性凋亡和凋亡抑制劑并不能阻止銅誘導的細胞死亡，而銅螯合劑、FDX1敲除和LIAS敲除各自部分卻可緩解銅離子載體產生的細胞殺傷作用。

最后，使用老年 ATP7B 缺陷小鼠 (Atpb7b?/?，銅失調綜合征 Wilson’s disease 模型) 與雜合子 (Atpb7b+/?) 和野生型對照小鼠對比，發現 ATP7B 缺陷小鼠的肝臟中蛋白的硫辛酰化水平和 Fe-S 簇蛋白的含量均有顯著降低，Hsp70 蛋白則有明顯增加。多種模型證明銅穩態失調導致的細胞死亡和銅離子載體誘導的細胞死亡是同一種機制。

圖6：銅誘導細胞死亡機制與銅穩態失調的遺傳模型相同

E、F：過表達SLC31A1，CuCl2 處理細胞
G、H：用 Nec-1 等處理過表達 SLC31A1 的細胞，加入 CuCl2，檢測細胞活力
I、J：天然細胞內銅伴侶谷胱甘肽的消耗導致銅依賴性細胞死亡，這可以在LIAS敲除后緩解
K：檢測 Atpb7b-/- 小鼠與對照組肝臟的蛋白質含量

七、總結

前面我們已經分析過細胞凋亡、焦亡、自噬、程序性壞死以及鐵死亡等，相關信號通路解讀、文章和視頻講座等資源都匯總到了小優的學術中心的細胞死亡大合集，有需要的戳鏈接自取呦。在此項研究中，作者證明了一種與現有已知的所有細胞死亡機制都不相同的新機制，取名為銅死亡（Cuprotosis）。

銅死亡依賴于線粒體呼吸——銅離子通過直接結合三羧酸循環途徑中的硫辛酰化蛋白，導致硫辛酰化蛋白異常聚集，并干擾呼吸鏈復合體中的鐵硫簇蛋白，引起蛋白質毒性應激反應，最終導致細胞死亡。在此過程中，FDX1和參與蛋白質硫辛酰化的六個基因是促進銅誘導死亡的關鍵基因，這些基因對線粒體有氧代謝至關重要。

圖7：銅死亡機制示意圖

在疾病研究方面，多種癌癥(包括乳腺癌、肺癌、胃腸道癌、口腔癌、甲狀腺癌、膽囊癌、卵巢癌和前列腺癌)患者的腫瘤或血清中，銅水平會異常升高。過量銅積累會危及生命，但可能存在一個窗口，使得細胞內銅的更集中增加可用于選擇性殺死癌細胞。新近發現的銅死亡為銅與癌癥的關系提供了思路。銅離子載體Elesclomol可結合環境中存在的銅并將其帶入細胞以誘導細胞死亡。Elesclomol 可能在表達大量硫辛酰化線粒體蛋白和高度呼吸的癌癥中效果好。這種方法可能對天然抵抗細胞凋亡的癌癥特別有用，通過利用這種金屬的作用，可以找到一種殺死癌細胞的新方法。

基于銅的抗癌機制，目前銅螯合劑和銅離子載體在多種腫瘤中已進行臨床前及臨床研究。其中銅螯合劑四硫鉬酸鹽（TTM） 、ATN-224 在乳腺癌中已經入II期臨床試驗。銅離子載體雙硫侖（DSF）治療惡性膠質瘤進入II期臨床試驗，Elesclomol治療黑色素瘤也進入了II期臨床試驗。

部分相關產品